Результат интеллектуальной деятельности: АНТИОКСИДАНТНОЕ СРЕДСТВО "КУРКУМЫ ЭКСТРАКТ ГУСТОЙ"

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к разработке и получению антиоксидантных лекарственных средств растительного происхождения.

Перспективным сырьевым источником является широко известная пряность - корневища куркумы длинной (Curcuma longa L.), растения семейства имбирные (Zingiberaceae). Пищевая ценность и широкий спектр фармакологического действия куркумы во многом обусловлены мощной антиоксидантной активностью и связаны со значительным содержанием куркуминоидов - основных полифенолов растения (не менее 2%, иногда и 5%), заслуживает внимания и эфиромасличный комплекс биологически активных соединений (1).

Анализ ассортимента различных фитосубстанций из куркумы (от собственно измельченного сырья, смеси куркуминоидов разной степени очистки до индивидуального куркумина и его производных) на российском рынке показывает доминирование продуктов функционального питания или биологически активных добавок к пище («лекарством не являются») зарубежного производства и отсутствие экстракционных препаратов, представляющих собой нативную гамму биологически активных соединений (БАС), в частности, в форме густого экстракта - наиболее технологичного и стабильного для данного растения. Официальными лекарственными средствами куркумы в Российской Федерации являются импортные желчегонные монопрепараты «Соларен» и «Фебихол», а также комбинированные препараты «Холивер», «Гепатофальк планта», «Холагогум» и комплексный сироп от кашля «Суприма-бронхо». В составе некоторых из этих препаратов заявлен густой экстракт куркумы, который по своему составу не является нативной гаммой соединений, а либо - субстанцией, полученной на основе сухого экстракта куркумы, либо представлен отдельными фракциями БАС (2).

Вариантом решения обозначенной проблематики является получение нативного комплекса куркуминоидов в форме экстракта густого.

Известен способ получения полифенольного комплекса веществ (основные - флавоноиды) из травы первоцвета весеннего (Primula veris L.) в форме густого экстракта, включающий стадию дробной мацерации с использованием 70% спирта этилового (троекратная экстракция с временем экспозиции 3 суток) и последующего отгона растворителя под вакуумом и выпаривания в сушильном шкафу при температуре 60°С до состояния густого экстракта (3).

Содержание целевой группы полифенольных БАС - суммы флавоноидов в пересчете на рутин в густом экстракте из травы первоцвета весеннего составляет от 6,68% до 7,31% (4).

Недостатками данной разработки является факт исходного обращения к указанному виду сырья, в котором содержание флавоноидов составляет 3,13%-5,48%, а предложенный способ получения не позволяет (исходя из содержания анализируемой группы в готовом продукте) исчерпывающе и избирательно извлечь целевую группу БАС, что в итоге не позволяет достичь высокой антиоксидантной активности полученного густого экстракта (табл. 1).

Данная разработка взята за прототип.

Целью изобретения является разработка технологии получения «Куркумы экстракта густого», обладающего высокой антиоксидантной активностью.

Указанная цель достигается за счет получения густого экстракта из корневищ куркумы длинной методом циркуляционной экстракции из расчета времени процесса 3,0 часа для экстрагирования 100,0 г суховоздушного сырья при его влажности не более 8% с использованием 96% спирта этилового, подкисленного 0,1 М раствором хлороводородной кислоты в соотношении: 1,0 мл раствора хлороводородной кислоты на 100,0 мл экстрагента, и последующего сгущения извлечения на ротационном испарителе под вакуумом до остаточной влаги в продукте не более 25%.

Применение циркуляционной экстракции позволяет использовать наиболее эффективный для целевых БАС (куркуминоидов) малополярный экстрагент - 96% спирт этиловый, подкисленный хлороводородной кислотой с целью придания стабильности куркуминоидам на этапе получения. В процессе последующей отгонки растворителя хлороводородная кислота полностью испаряется из готового продукта. Все это позволяет достичь выхода целевых БАС на уровне 85% от исходно содержащихся в сырье и обеспечить содержание суммы куркуминоидов в готовом продукте не менее 45%, дополнительно извлечь ценный терпеноидный комплекс растения (1), полный технологический цикл провести за 3 часа, исходя из 100,0 г исходного суховоздушного сырья.

Разработанный способ реализуется следующим образом. Для получения густого экстракта куркумы навеску измельченного суховоздушного сырья (влажность не более 8%) упаковывают в патрон из фильтровальной бумаги или в специальную гильзу, помещают в цилиндрическую часть аппарата Сокслета и после герметичного соединения колбы для экстрагента (приемная колба) с экстрактором наливают растворитель - 96% спирт этиловый, подкисленный 0,1 М раствором кислоты хлороводородной в соотношении: 1,0 мл раствора кислоты на 100,0 мл экстрагента, до тех пор, пока экстрагент не начнет стекать по сифонной трубке в приемную колбу. Когда растворитель стечет полностью, его добавляют еще раз в половинном объеме от уже налитого в экстрактор, затем герметично присоединяют обратный холодильник с водяным охлаждением, приемную колбу с экстрагентом устанавливают на нагревательный прибор и начинают нагревать.

По достижении кипения пары растворителя через пароотводную трубку поступают в экстрактор и далее в холодильник, там конденсируются и стекают в цилиндрическую часть аппарата Сокслета, где процесс экстракции сырья протекает в циркуляционном режиме до полного обесцвечивания извлечения в экстракторе (куркуминоиды имеют яркий желто-оранжевый цвет), что по времени занимает 2,5-3,0 часа. После последнего слива установку разбирают, полученное извлечение остужают при комнатной температуре и отстаивают 24 часа в прохладном месте. Затем извлечение фильтруют и упаривают при температуре, не превышавшей 60°С, в роторном испарителе до консистенции густого экстракта (допустимо завершение упаривания в выпарительных чашках) до остаточной влажности не более 25%. Проверяют параметры качества готового продукта: содержание суммы куркуминоидов - не менее 45%, содержание влаги - не более 25% и другие фармакопейные параметры качества, нормируемые для густых экстрактов. Упаковку и хранение готового продукта проводят по общепринятым требованиям (срок годности - 2 года).

Заявляемый способ иллюстрируется следующими примерами

Пример 1. Для получения густого экстракта куркумы было взято 100,0 г суховоздушных цельных корневищ куркумы длинной (влажность 5,6%), сырье было измельчено до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 3,0 мм. Подготовленное таким образом сырье упаковали в патрон из фильтровальной бумаги и поместили его в цилиндрическую часть аппарата Сокслета с емкостью цилиндрической части на 200,0 мл (до верхнего перегиба сифонной трубки), герметично соединили приемную колбу (с магнитной мешалкой) с экстрактором, налили растворитель - 96% спирт этиловый, подкисленный 0,1 М раствором кислоты хлороводородной в соотношении: 1,0 мл раствора кислоты на 100 мл экстрагента, до тех пор, пока экстрагент не начал стекать по сифонной трубке в приемную колбу, что соответствовало 100,0 мл экстрагента. После полного стекания растворителя еще раз его добавили в экстрактор в объеме 50,0 мл, затем герметично присоединили обратный холодильник, охлаждаемый водой, приемную колбу с экстрагентом установили на плитку с асбестовой сеткой и начали нагревать.

Растворитель в колбе нагрели до умеренного кипения. При этом пары растворителя через пароотводную трубку поступали в экстрактор и далее в холодильник, там конденсировались и стекали в цилиндрическую часть аппарата Сокслета, где процесс экстракции сырья протекал в циркуляционном режиме 3 часа до полного обесцвечивания извлечения в экстракторе, что составило 15 циклов (сливов). После последнего слива, установку разобрали, полученное извлечение охладили при комнатной температуре и отстаивали еще 24 часа в прохладном месте (в холодильнике при температуре 8-10°С). Затем извлечение профильтровали через двойной бумажный фильтр и упарили при температуре около 55°С в роторном испарителе до консистенции густого экстракта; выход готового продукта составил 8,7 г с содержанием влаги 20%.

С использованием известных методик качественного и количественного анализа куркуминоидов в сырье (1) установлено содержание суммы куркуминоидов в готовом продукте: оно составило 47,2% в пересчете на сухое вещество; установлено соответствие и другим фармакопейным параметрам качества для густых экстрактов. Полученный экстракт - вязкий, коричнево-оранжевого цвета, имеет пряный, ароматный запах, специфический для куркумы, и горьковатый вкус.

Пример 2. Для получения густого экстракта куркумы было взято 100,0 г суховоздушных порошкованных корневищ куркумы длинной с размером частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1,0 мм (влажность 6,2%).

Экстракт получали в соответствии с примером 1. Выход готового продукта составил 9,1 г с содержанием влаги 21% и содержанием суммы куркуминоидов 47,5% в пересчете на сухое вещество. Органолептические свойства и другие параметры качества аналогичны таковым для экстракта из цельного сырья.

Данные примеры доказывают равную возможность использования как цельного, так и порошкованного суховоздушного сырья куркумы длинной для получения густого экстракта заявляемым способом, а также принципиальные преимущества перед прототипом по содержанию действующих веществ в готовом продукте: суммы куркуминоидов не менее 45% - в густом экстракте куркумы, тогда как в густом экстракте из травы первоцвета весеннего содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин составляет от 6,68% до 7,31%.

Преимущества предложенного подхода были подтверждены результатами исследования антиоксидантной активности средства «Куркумы экстракт густой».

Изучение влияния экстракта куркумы густого на процессы свободнорадикального окисления проводили в модельных системах (МС) in vitro с использованием экспресс-метода определения антиоксидантной активности, основанного на регистрации хемилюминесценции (ХЛ) - свечения, возникающего при взаимодействии свободных радикалов. Так же как и в случае прототипа изобретения (табл. 1) были использованы две МС: генерирующая активные формы кислорода (АФК) и моделирующая перекисное окисление липидов (ПОЛ). Исследования реализованы следующим образом.

Методика 1. В качестве МС, где генерировались АФК, использовали 20 мл фосфатного буфера (20 мМ KH₂PO₄, 105 мМ KCl) с добавлением раствора люминола (10^-5 М) и цитрата натрия (50 мМ). Величину рН полученного раствора доводили до 7,45 ед. титрованием насыщенным раствором едкого калия. Для инициирования реакций, сопровождающихся образованием АФК, вводили 1 мл 50 мМ раствора солей Fe²⁺. Конечная концентрация ионов Fe²⁺ в среде инкубации составила 2,5 мМ. Регистрация свечения продолжалась в течение 5 минут при постоянном перемешивании.

ХЛ регистрировали на установке ХЛМ-003 (Россия). ХЛ МС характеризовалась спонтанным свечением, быстрой вспышкой и развивающейся затем медленной вспышкой. Основными наиболее информативными характеристиками ХЛ служили светосумма свечения, определяющаяся по интенсивности излучения, и амплитуда максимального свечения (5).

Данные о влиянии экстракта куркумы густого в сравнительном аспекте с препаратом сравнения (масляный раствор альфа-токоферола ацетата) на ХЛ в МС, генерирующей АФК, представлены соответственно на фиг. 1 и 2, а также в табл. 2. Препарат сравнения незначительно удлинял латентый период и уменьшал величину светосуммы ХЛ (фиг. 1). Исследуемый экстракт значительно удлиняет латентный период и почти в 6 раз уменьшает величину светосуммы ХЛ (фиг. 2). Полученные данные показывают принципиальные преимущества экстракта куркумы густого перед препаратом сравнения, а также доказывают существенно более сильное угнетающее влияние на светосумму свечения в МС, генерирующей АФК, по сравнению с прототипом, причем в меньших дозировках (табл. 1).

Методика 2. МС, в которой протекают реакции ПОЛ, основана на высокой окисляемости липидов куриного желтка, сходных по составу с липидами крови. Липиды получают путем гомогенизирования куриного желтка в фосфатном буфере в соотношении 1:5 и последующим разбавлением в 20 раз, отбирали 20 мл. Добавление в систему 1 мл 50 мМ раствора Fe²⁺ ведет к инициированию окисления ненасыщенных жирных кислот, что сопровождается ХЛ. По интенсивности свечения судят о процессах ПОЛ (5).

В сериях экспериментов с обеими МС в 20 мл смесей для определения АФК и ПОЛ добавляли по 0,1 мл и 0,01 мл исследуемых веществ - образцы густых экстрактов куркумы, полученных тремя ранее приведенными способами, и препарат сравнения - альфа-токоферола ацетат. В качестве контроля служили МС без добавления исследуемых препаратов (в тех же объемах добавляли физиологический раствор).

Данные о влиянии экстракта куркумы густого в сравнительном аспекте с препаратом сравнения (масляный раствор альфа-токоферола ацетата) на ХЛ в МС, представлены соответственно на фиг. 3 и 4, а также в табл. 3. В отличие от препарата сравнения (который проявляет себя как прооксидант в данной МС), внесение в МС желточных липопротеидов экстракта куркумы густого даже в наименьшей концентрации сопровождалось значительным уменьшением амплитуды быстрой и медленной вспышек, увеличением длительности латентного периода, снижением значения максимальной светимости (фиг. 4).

Уровень свечения МС при добавлении экстракта куркумы густого в объеме даже 0,01 мл подавлялся практически до нуля, следовательно, полученный экстракт может рассматриваться как активный антиоксидант перекисного окисления липидов.

В обеих МС исследуемые густые экстракты куркумы действовали в одинаковом направлении: снижали процессы образования свободных радикалов, и в уровне своего воздействия превосходили как препарат сравнения (альфа-токоферола ацетат), так и густой экстракт первоцвета весеннего, взятый за прототип изобретения (табл. 1. 2, 3).

В результате проведенных исследований методом регистрации ХЛ была выявлена способность «Куркумы экстракта густого» активно подавлять генерацию АФК и ПОЛ в модельных системах, что характеризует высокий уровень антиоксидантной активности и показывает перспективность дальнейших исследований разработанного средства растительного происхождения в качестве самостоятельного лекарственного препарата или в составе других лекарственных форм для профилактики и лечения широкого спектра заболеваний, связанных с ослаблением или нарушением антиоксидантной системы защиты организма.

Таким образом, заявленное антиоксидантное средство «Куркумы экстракт густой» по сравнению с прототипом обладает следующими преимуществами:

1. Использование в качестве исходного сырья корневищ куркумы длинной, в которых содержатся значительные количества БАС с высокой антиоксидантной активностью - куркуминоидов от 2% до 5% (в прототипе - это флавоноиды с сопоставимым содержанием, но более низкой антиоксидантной активностью).

2. Использование метода циркуляционной экстракции и в качестве экстрагента 96% спирта этилового, подкисленного 0,1 М раствором кислоты хлороводородной, для получения густого экстракта куркумы обеспечивает извлечение нативного комплекса БАС (на уровне 85% от исходно содержащихся в сырье, в прототипе - не выше 50%).

3. Значительное сокращение стадии экстракции сырья: 3 часа в предложенном способе и 9 суток в прототипе.

4. Содержание в готовом продукте основных действующих БАС (суммы куркуминоидов) не менее 45% - более высокое по сравнению с прототипом (примерно в 6 раз).

5. Высокая активность разработанного средства в подавлении генерации активных форм кислорода и перекисного окисления липидов в модельных системах: в 6 раз и в 17 раз сильнее, чем в прототипе соответственно.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Ibraheem R., Al-Wabli R.I. Synthesis of Curcumin Analogues Biconjugates as Potential Antitumor Agents in Isolated Human Cells // B. Pharm. Sci. - 1426 A.H. - 2006 A.D. - 150 p.

2. Gupta S.C, Patchva S., Bharat B. Therapeutic Roles of Curcumin: Lessons Learned from Clinical Trials // AAPS J. - 2013. - No 15(1). - P. 195-218.

3. Патент РФ №2342942 на изобретение «Средство растительного происхождения, обладающее антиоксидантной активностью»; Заявка №2007144096/15 от 16.11.2007 г.; Бюл. №1 от 10.01.09 г.

4. Латыпова Г.М. Экспериментально-теоретическое обоснование рационального использования растений рода Primula L. и рода Humulus L. // автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук / Самарский государственный медицинский университет. Самара, 2015.

5. Фархутдинов P.P., Тевдорадзе С.И. Методики исследования хемилюминесценции биологического материала на хемилюминометре ХЛ-003 // Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения: Сборник докладов. Под ред. проф. Е.Б. Бурлаковой. - М.: Изд-во РУДН, 2005. - С. 147-154.