×
10.05.2018
218.016.3d81

Новый сульфатированный фукоолигосахарид и способ его получения

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены новый сульфатированный фукоолигосахарид формулы II, представленной на фиг.3, и способ его получения. Осуществляют обработку фукоидана из Sargassum horneri рекомбинантной фукоиданазой FFA1 в Tris-HCl буфере с рН 7,2 при 37°С в течение 72-75 ч. Затем нагревают до 100°C в течение 5-10 мин. Далее высокомолекулярные продукты гидролиза осаждают 75% водным раствором этанола или ацетона. Затем образовавшийся осадок отделяют с помощью центрифугирования при 9000-10000 g в течение 20-30 мин. Супернатант наносят на колонку с анионообменным сорбентом, уравновешенную водой, и элюируют фукоолигосахариды линейным градиентом гидрокарбоната аммония со скоростью 1 мл/мин. Сначала элюируют сульфатированный фукоолигосахарид формулы II, затем сульфатированный фукоолигосахарид формулы I. Полученные фракции целевых продуктов лиофильно высушивают. Изобретение расширяет арсенал сульфатированных фукоолигосахаридов, полученных из бурой водоросли Sargassum horneri. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 2 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения новых сульфатированных фукоолигосахаридов из фукоиданов. Эти соединения могут быть использованы в научных исследованиях, а также в медицине, косметологии, сельском хозяйстве.

Фукоиданы - сульфатированные гетерополисахариды бурых водорослей обладают широким спектром биологической активности [Fitton, J.H., Stringer, D.N., and Karpiniec, S.S. (2015). Therapies from Fucoidan: An Update. Marin Drugs 13, 5920-5946]. Однако использование полимерных молекул в медицине практически невозможно из-за гетерогенности препаратов полисахаридов и невозможности их стандартизации. Поэтому стоит проблема получения из фукоидана олигосахаридов, имеющих постоянные структуры и стандартные характеристики. Применение ферментов для деполимеризации биологически активных фукоиданов и получение олигосахаридов открывает новые возможности использования этих соединений в фармацевтике и косметологии [Kusaykin, M.I., Silchenko, A.S., Zakharenko, A.M., and Zvyagintseva, T.N. (2016). Fucoidanases. Glycobiology 26, 3-12].

Описано использование фукозилированных олигосахаридов в составе композиции, используемой для предупреждения и/или лечения атопического дерматита и экземы [RU 2586776 С2, 10.06.2016], желудочно-кишечной инфекции [WO2016139333 А1, 09.09.2016]. Предложены новые N-сульфатированные олигосахариды, стимулирующие образование сосудов [RU 2559629 С2, 10.08.2015], а также новые сульфатированные производные олигосахаридов, эффективные в качестве ингибиторов гепаринсульфат-связывающих белков [RU 2483074 С2, 27.05.2013]. Известны фукоолигосахариды, которые могут быть использованы для защиты растений от патогенов [US 6984630 В1, 10.01.2006].

По сравнению с получением сульфатированных олигосахаридов многостадийным методом органического синтеза, ферментативное получение подобных олигосахаридов из фукоиданов отличается меньшей трудоёмкостью, существенно меньшим числом стадий получения и высоким выходом продуктов реакции.

Описано получение фукоолигосахаридов из фуканов деполимеризацией с помощью бактериальных эндофуканаз [US 6984630 В1, 10.01.2006].

Описано получение фукоолигосахаридов, используемых в области гликотехнологии, с помощью ферментов из фукоидана, полученного из бурых водорослей порядка Laminarinales. [US 6927289 В2, 09.08.2005].

Раннее нами были получены фукоолигосахариды ферментативным гидролизом фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens. Для этого фукоидан смешивали с нативной фукоиданазой FFA из морской бактерии Formosa algae в 0,015 М Na-фосфатном буфере, рН 7,2 и инкубировали в течение 72 ч при 25ºС. Высокомолекулярные продукты гидролиза осаждали 75% водным раствором этанола. Выпавший осадок центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин. Супернатант упаривали на роторном испарителе, растворяли в дистиллированной воде и наносили на термостатируемую колонку с биогелем Р-6, уравновешенную водой. Фукоолигосахариды элюировали со скоростью 0,7 мл/мин. Присутствие сахаров в исследуемых фракциях проверяли фенол-сернокислотным методом. Низкомолекулярные фракции олигосахаридов объединяли, концентрировали на роторном испарителе и рехроматографировали. В результате получали дисахариды [Сильченко А.С. Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp: диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток, 2014, стр. 69].

На фиг. 1 (А, Б) представлены структуры дисахаридов.

Задача изобретения – расширение арсенала сульфатированных фукоолигосахаридов. Задача решена разработкой способа их получения из фукоидана, выделенного из бурой водоросли Sargassum horneri.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в получении новых сульфатированных фукоолигосахаридов постоянной структуры из фукоидана из Sargassum horneri.

В доступной патентной и другой научно-технической литературе заявляемые сульфатированные фукоолигосахариды не обнаружены.

Заявляемый сульфатированный фукоолигосахарид формулы I состоит из остатков фукозы (n=4), связанных чередующимися 1→3;1→4 гликозидными связями, сульфатные группы расположены при С2 в 1→3-связанных остатках фукозы, и при С2 и С3 в 1→4-связанных остатках фукозы.

На фиг. 2 представлена структура сульфатированного фукоолигосахарида формулы I.

Заявляемый сульфатированный фукоолигосахарид формулы II состоит из остатков фукозы (n=6), связанных чередующимися 1→3;1→4 гликозидными связями, сульфатные группы расположены при С2 в 1→3-связанных остатках фукозы, и при С2 и С3 в 1→4-связанных остатках фукозы, к третьему моносахаридному остатку, которого присоединена боковая цепь с 1→4 гликозидной связью, состоящая из 2 остатков несульфатированной фукозы, связанных между собой 1→2 гликозидной связью.

На фиг. 3 представлена структура сульфатированного фукоолигосахарида формулы II.

Заявляемый способ получения сульфатированных фукоолигосахаридов формул I и II заключается в том, что рекомбинантную фукоиданазу FFA1 в Tris-HCl буфере рН 7,2 смешивают с 5-10% раствором фукоидана из Sargassum horneri, смесь инкубируют при 37°С в течение 72-75 часов, затем нагревают до 100°С в течение 5-10 мин, далее высокомолекулярные продукты гидролиза осаждают 75% водным раствором этанола или ацетона, затем образовавшийся осадок отделяют с помощью центрифугирования при 9000-10000 g в течение 20-30 мин, а супернатант наносят на колонку с анионообменным сорбентом, уравновешенную водой, и элюируют фукоолигосахариды линейным градиентом гидрокарбоната аммония со скоростью 1 мл/мин, сначала сульфатированный фукоолигосахарид формулы II, затем сульфатированный фукоолигосахарид формулы I, далее полученные фракции целевых продуктов лиофильно высушивают.

Рекомбинантную фукоиданазу FFA1 получают известным способом [Сильченко А.С. Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp: диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток, 2014, стр. 110].

Фукоидан получают из бурой водоросли Sargassum horneri по известной методике [Zvyagintseva, T. N., Shevchenko, N. M., et.al. (1999). A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds. Carbohydr. Res. 322, 32-39].

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

ПРИМЕР 1

Рекомбинантную фукоиданазу FFA1 (1 мг) в Tris-HCl буфере, рН 7,2 смешивают с 5% раствором фукоидана из Sargassum horneri. Смесь инкубируют при 37°С в течение 72 ч, затем нагревают до 100°С в течение 5 мин. Образовавшийся осадок отделяют с помощью центрифугирования и отбрасывают. В супернатант добавляют этанол до достижения его концентрации 75%. Выпавший осадок (высокомолекулярная фракция) центрифугируют при 9000 g в течение 20 мин. Супернатант (низкомолекулярная фракция) наносят на колонку с сорбентом Q-Sepharose, уравновешенную водой. Олигосахариды элюируют линейным градиентом гидрокарбоната аммония со скоростью 1 мл/мин, сначала сульфатированный фукоолигосахарид формулы II, затем сульфатированный фукоолигосахарид формулы I. Полученные фракции олигосахаридов лиофильно высушивают. Выход целевых продуктов составляет 5-15% от веса низкомолекулярной фракции.

ПРИМЕР 2

Рекомбинантную фукоиданазу FFA1 (1 мг) в Tris-HCl буфере, рН 7,2 смешивают с 10% раствором фукоидана из Sargassum horneri. Смесь инкубируют при 37°С в течение 75 ч, затем нагревают до 100°С в течение 10 мин. Образовавшийся осадок отделяют с помощью центрифугирования и отбрасывают. В супернатант добавляют ацетон до достижения его концентрации 75%. Выпавший осадок (высокомолекулярная фракция) центрифугируют при 10000 g в течение 30 мин. Супернатант (низкомолекулярная фракция) наносят на колонку с сорбентом Mono-Q, уравновешенную водой. Олигосахариды элюируют линейным градиентом гидрокарбоната аммония со скоростью 1 мл/мин, сначала сульфатированный фукоолигосахарид формулы II, затем сульфатированный фукоолигосахарид формулы I. Полученные фракции олигосахаридов лиофильно высушивают. Выход целевых продуктов составляет 7-20% от веса низкомолекулярной фракции.

Структура полученных олигосахаридов была установлена с помощью ЯМР спектроскопии.

На 1H-спектре олигосахарида формулы I были обнаружены химические сдвиги, принадлежащие четырём разным остаткам α-метил-L-фукопиранозида, обозначенным буквами a-d, представленные в таблице 1. С помощью спектров 1DTOXY и COSY были определены хим. сдвиги, принадлежащие каждому остатку, и их последовательность. Из HSQC-спектра было установлено соотношение между хим. сдвигами 1H и 13C. Спектр ROESY показал корреляцию между H1 остатка d и H4 остатка c, H1 остатка c и H3 остатка a, H1 остатка b и H3 и H4 остатка d. В спектре HMBC наблюдалась связь между С1 остатка d и H4 остатка c, С1 остатка c и H3 остатка a, С1 остатка b и H3 и остатка d. Аналогично протоны d1, c1 и b1 коррелировали с атомами углерода c4, a3 и d3 соответственно. На основании этого был сделан вывод, что олигосахарид формулы I имеет углеродный скелет α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp-1→4-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp.

Спектр 1H снят при 700 MHz, 308 К, хим. сдвиги измерены относительно хим. сдвига ацетона 2,225. Спектр 13С снят при 700 MHz, 308 К, хим. сдвиги измерены относительно хим. сдвига ацетона 31,45.

Аналогичным образом была установлена структура олигосахарида формулы II. 1H-спектр показал наличие шести разных моносахаридных остатков. Спектры 1DTOXY, COSY и HSQC позволили установить протонные и углеродные хим. сдвиги каждого из них, представленные в таблице 2.

На спектре ROESY наблюдается корреляция между H1 остатка a’ и H4 остатка d’, H1 остатка e’ и H3 остатка d’, H1 остатка d’ и H4 остатка c’, H1 остатка c’ и H3 остатка b’, H1 остатка f’ и H2 остатка a’. В спектре HMBC атомы углерода a’1, d’1, e’1, f’1, c’1 коррелируют с протонами d’4, c’4, d’3, a’2 и b’3 соответственно, а протоны a’1, e’1, f’1, d’1 – с атомами углерода d’4, d’3, a’2, c’4 соответственно. Кроме того, в спектре HMBC наблюдается связь атома углерода b’3 с протоном c’1 или d’1.

Спектр 1H снят при 700 MHz, 308 К, хим. сдвиги измерены относительно хим. сдвига ацетона 2,225. Спектр 13С снят при 700 MHz, 308 К, хим. сдвиги измерены относительно хим. сдвига ацетона 31,45.

На основании вышесказанного был сделан вывод, что олигосахарид формулы II имеет разветвлённую структуру вида

α-L-Fucp-1→2-α-L-Fucp-1↓4

α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp-1→4-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp.

Положение сульфатов в моносахаридных остатках было установлено путём сравнения сдвигов их протонов с фукозой (H1 = 5,19, H2 = 3,76, H3 = 3,85, H4 = 3,80, H5 = 4,19, H6 = 1,20) и сдвигов их углеродных атомов с α-метил-L-фукопиранозидом (C1 = 100,5, C2 = 69,0, С3 = 70,6, С4 = 72,9, С5 = 67,5, С6 = 16,5). Сульфатирование в положении 2 было вычислено из смещения H2 в слабое поле на 0,8-0,9 ppm относительно фукозы и C2 – на 4-6 ppm относительно α-метил-L-фукопиранозида. По сдвигу H3 в слабое поле на 0,9-1,0 ppm и C3 – на 4-6 ppm было установлено наличие сульфатов в положении 3.

Заявляемые сульфатированные фукоолигосахариды используют в научных исследованиях в качестве субстратов фукоиданаз, фукозидаз и сульфатаз.


Новый сульфатированный фукоолигосахарид и способ его получения
Новый сульфатированный фукоолигосахарид и способ его получения
Новый сульфатированный фукоолигосахарид и способ его получения
Новый сульфатированный фукоолигосахарид и способ его получения
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-10 из 41.
10.04.2013
№216.012.3308

Способ получения 6,7-замещенных 2,3,5,8-тетрагидрокси-1,4-нафтохинонов (спиназаринов)

Настоящее изобретение относится к способу получения 6,7-замещенных производных 2,3,5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинона (спиназаринов) формулы I, где R и R оба одновременно обозначают Н, Me, Cl, или R=H, a R=Me, Et, t-Bu, Cl, OMe; R=Me, a R=Cl, OMe, OEt, OH; R=Et, a R=Cl, OMe, OEt, OH, которые могут...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002478607
Дата охранного документа: 10.04.2013
10.08.2013
№216.012.5d0b

Способ получения эстрогенсвязывающего белка, ассоциированного со злокачественными новообразованиями

Изобретение относится к биотехнологии и медицине (практической онкологии), а именно к разработке способа получения эстроген-связывающего белка эмбриональной природы (ЭСБ). Способ предусматривает следующее. Осадок А (отход, получаемый при промышленном получении гамма-глобулиновой фракции из...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002489440
Дата охранного документа: 10.08.2013
10.10.2013
№216.012.719d

Средство, ингибирующее множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и фармацевтической промышленности. Изобретение обеспечивает применение тритерпеновых гликозидов из голотурий фрондозида А или комплекса фрондозида А с холестерином в качестве средства, ингибирующего множественную лекарственную устойчивость...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002494742
Дата охранного документа: 10.10.2013
20.01.2014
№216.012.97e4

Плазмида 40gal, определяющая синтез α-галактозидазы α-psgal, штамм e.coli rosetta(de3)/40gal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность α-psgal, и способ ее получения

Изобретение относится к области биохимии и представляет собой плазмиду, определяющую синтез α-галактозидазы α-PsGal, включающую NcoI/SalI - фрагмент плазмиды pET-40b(+) (Novagen) и фрагмент ДНК, размером 2142 пар оснований, содержащий химерный ген, состоящий из структурной части гена α-PsGal,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002504583
Дата охранного документа: 20.01.2014
20.03.2014
№216.012.ac1c

Средство, обладающее противоопухолевой, антикоагулянтной, ранозаживляющей, противовоспалительной, антиоксидантной активностью, способностью ингибировать коллагеназу и ангиотензинпревращающий фермент (апф), и способ его получения

Изобретения относятся к биотехнологии и могут быть использованы для получения биологически активных пептидов коллагена. Морскую звезду Patiria pectinifera обезвоживают 96% этиловым спиртом, затем деминерализируют 1-2 N раствором минеральной кислоты при соотношении сырье:минеральная кислота...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002509775
Дата охранного документа: 20.03.2014
20.08.2014
№216.012.e9e2

Плазмида 40nagal, определяющая синтез α-n-ацетилгалактозаминидазы α-alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной α-n-ацетилгалактозаминидазы α-alnagal, и способ ее получения

Изобретение относится к области биохимии и представляет собой плазмиду 40NaGal, определяющую синтез α-N-ацетилгалактозаминидазы α-AlNaGal, включающую NcoI/SalI-фрагмент плазмиды pET-40b(+) (Novagen) и фрагмент ДНК размером 1299 пар оснований, содержащий химерный ген, состоящий из структурной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002525682
Дата охранного документа: 20.08.2014
20.11.2014
№216.013.074a

Способ фотон-захватной терапии опухолей

Изобретение относится к медицине, а именно к лучевой терапии опухолей. Способ включает введение в опухоль средства, содержащего наноразмерные частицы золота и йодсодержащее контрастное вещество. Данное средство вводят непосредственно в опухоль, после чего проводят обработку опухоли фотонным...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002533267
Дата охранного документа: 20.11.2014
27.11.2014
№216.013.0c2d

Гликозидные производные 1,2-дитиол-3-тиона или 1,2-дитиол-3-она и лекарственные средства на их основе

Настоящее изобретение относится к гликозидным производным 1,2-дитиол-3-тиона или 1,2-дитиол-3-она формулы 1, где R=S или O; R является остатком пер-O-ацетил D-глюкозы, пер-O-ацетил D-галактозы, пер-O-ацетил D-маннозы, пер-O-ацетил D-ксилозы, пер-O-ацетил L-арабинозы, пер-O-ацетил D-мальтозы...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002534525
Дата охранного документа: 27.11.2014
20.12.2014
№216.013.12c2

Средство, обладающее гастропротекторной активностью

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к применению водорастворимого полиэлектролитного комплекса каппа-каррагинан:хитозан при соотношении компонентов 1:10 в/в с молекулярной массой каппа-каррагинана 311 кДа и с молекулярной массой хитозана 115 кДа и степенью N-ацетилирования 6%...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002536225
Дата охранного документа: 20.12.2014
10.01.2015
№216.013.1a55

Рекомбинантная плазмидная днк pet40cmap/mbl-t, кодирующая гибридный бифункциональный полипептид cmap/mbl-t со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы cmap и маннан-связывающего лектина с-типа mbl-t, рекомбинантный штамм e.coli rosetta(de3)/pet40cmap/mbl-t - продуцент гибридного бифункционального полипептида cmap/mbl-t и способ его получения

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой плазмиду pET40CmAP/MBL-T, определяющую синтез гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina (CmAP) и маннан-связывающего лектина С-типа...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002538169
Дата охранного документа: 10.01.2015
Показаны записи 1-8 из 8.
27.01.2013
№216.012.1e30

Начинка для кондитерских и хлебобулочных изделий

Изобретение относится к пищевой промышленности. Начинка включает протертый в пюре плодово-ягодный наполнитель, сахар и продукт из бурой водоросли. В качестве плодово-ягодного наполнителя содержит протертые в пюре ягоды черной смородины. В качестве продукта из бурой водоросли содержит...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002473229
Дата охранного документа: 27.01.2013
10.08.2013
№216.012.5bf0

Способ немедикаментозного лечения больных с хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта

Изобретение относится к медицине и предназначено для лечения хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта. Используют синбиотический напиток, содержащий бифидобактерии и иммуноактивные полисахариды из бурой водоросли F.evanescens. Доза 200 мл в день в 2 приема за 30 мин до еды, курс 6...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002489157
Дата охранного документа: 10.08.2013
20.10.2015
№216.013.8769

Ингибитор протеинкиназы торк с направленным хемопревентивным действием in vitro

Изобретение относится к медицине, конкретно к онкологии, и касается ингибиторов, обладающих направленным хемопревентивным действием через подавление активности протеинкиназы ТОРК. Применение фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens в качестве ингибитора протеинкиназы ТОРК с направленным...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002566268
Дата охранного документа: 20.10.2015
29.12.2018
№218.016.acbe

Адъювант для противовирусных вакцин

Изобретение предназначено для использования в медицине, в частности в иммунологии, и может быть использовано для получения адъюванта противовирусных вакцин против вирусов гепатита В или гриппа. Для этого в качестве адъюванта применяют фукоидан, полученный из бурой водоросли Fucus evanescens с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002676266
Дата охранного документа: 27.12.2018
11.03.2019
№219.016.dac3

Способ переработки бурых водорослей

Изобретение относится к технологии переработки бурых водорослей. Сырые или замороженные водоросли подвергают гидролизу водным раствором соляной кислоты, экстракт сливают и направляют на извлечение водорастворимых полисахаридов осаждением их этиловым спиртом. Остаток экстрагируют 96% этиловым...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002360545
Дата охранного документа: 10.07.2009
20.03.2019
№219.016.e735

Пористый сорбент с гепатопротекторными свойствами

Изобретение относится к области пористых материалов, адсорбентов медицинского назначения, носителей ферментов, клеток, лекарственных препаратов, биологически активных веществ Берут углеродминеральный сорбент, которому придают наряду с его детоксицирующими свойствами специфические...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002329864
Дата охранного документа: 27.07.2008
19.04.2019
№219.017.2ea2

Биологически активный продукт из бурой водоросли, биологически активная добавка к пище, безалкогольный напиток, парфюмерно-косметическое средство

Группа изобретений относится к пищевой и косметологической промышленности и касается биологически активных продуктов из бурых водорослей. Биологически активный продукт представляет собой полисахаридную композицию, полученную из водоросли Fucus evanescens, состоящую из фукоидана в количестве...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002315487
Дата охранного документа: 27.01.2008
18.05.2019
№219.017.5825

Средство, обладающее противовирусной активностью

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и используется в качестве средства против вируса Hantaan - возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Применение фукоидана в качестве средства, обладающего противовирусной активностью в отношении вируса Hantaan -...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002304443
Дата охранного документа: 20.08.2007
+ добавить свой РИД