Результат интеллектуальной деятельности: Способ неинвазивной диагностики состояния и организации внутриклеточного хроматина в GV-ооците млекопитающих

Изобретение относится к области медицины, а именно к области воспроизведения млекопитающих, и может быть использовано при отбраковке ооцитов, предлагаемых для использования при искусственном воспроизведении млекопитающих.

Известен (BY, патент 5700, опубл. 30.12.2003) способ оценки качества ооцитов крупного рогатого скота. Согласно известному способу оценку осуществляют по величине внутриклеточного потенциала (ВКП), измеряемого перед отправкой ооцитов на созревание, при этом к отличному качеству относят ооциты, (ВКП) которых составляет более 7 мВ, к хорошему качеству - ооциты, ВКП которых измеряется в пределах от 4,0 до 7,0 мВ, к удовлетворительному качеству - от 1,5 до 4,0 мВ. ВКП измеряли с использованием микроэлектродного усилителя ИС-01И в милливольтах.

Известен также (RU, патент 2193777, опубл. 27.11.2002) способ прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ путем качественной и количественной оценки содержимого фолликулов, отличающийся тем, что в фолликулярной жидкости, аспирированной раздельно из правого и левого яичников, исследуют активность пептид-гидролаз и при ее уровне не менее 75 мг/мл/ч в одном из яичников прогнозируют благоприятный исход.

Известен (SU, авторское свидетельство 1768153, опубл. 15.10.92) способ определения жизнеспособности эмбрионов млекопитающих. Согласно известному способу определяют жизнеспособность эмбрионов млекопитающих по изменению светопроницаемости отдельных его участков за определенный интервал времени.

Все перечисленные технические решения не способны решить задачу неинвазивной диагностики состояния и организации внутриклеточного хроматина в GV-ооцитах млекопитающих.

Техническая задача, решаемая посредством разработанного способа, состоит в разработке неинвазивной диагностики состояния и организации внутриклеточного хроматина в GV-ооцитах млекопитающих.

Технический результат, достигаемый в результате реализации способа, состоит в повышении быстродействия и точности определения состояния и организации внутриклеточного хроматина в GV-ооцитах млекопитающих.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ неинвазивной диагностики состояния и организации внутриклеточного хроматина в GV-ооцитах млекопитающих. Согласно разработанному способу осуществляют захват оптическим микропинцетом ядрышкоподобного тельца в зародышевом пузырьке ооцита, находящегося в начальной стадии развития, приводящий к смещению и деформации ядрышкоподобного тельца внутри клетки, с последующей оценкой состояния и организации внутриклеточного хроматина в GV-ооцитах млекопитающих по величине смещения ядрышкоподобного тельца и его деформации, причем в случае смещения центра ядрышкоподобного тельца данный ооцит относится к NSN типу, а в случае деформации тельца либо полном отсутствии эффекта ооцит относится к SN типу.

Объектом исследования является половая клетка мыши - ооцит. Ооцит мыши удобен для изучения, поскольку является крупным (зрелые ооциты достигают порядка 80 микрон) и подходит для изучения ядерных структур, так как с начальных этапов оогенеза в нем легко различим зародышевый пузырек (от англ. GV - germinal vesicle), в котором располагается ядрышко и окружающий его хроматин). Ядро ооцита в составе предовуляторного фолликула традиционно называют «зародышевым пузырьком» (germinal vesicle, GV), а ооциты таких фолликулов - GV ооцитами.

Для оценки степени зрелости ооцитов используют самые разные параметры, как морфологические (размер ооцита, положение зародышевого пузырька, размер перивителлинового пространства, положение ядрышка, распределение хроматина в ядре), так и биохимические (транскрипционная активность ДНК, уровень экспрессии генов, ассоциированных с мейотическим делением и преимплантационным и эмбриональным развитием, особенности синтетических процессов).

Наиболее значимый критерий - конфигурация хроматина в ядре. В зависимости от положения и характера конденсации хроматина ооциты подразделяются на следующие группы: NSN (от англ. - non-surrounded nucleolus), pSN (от англ. partially surrounded nucleolus), SN (от англ. Surrounded nucleolus). NSN конфигурация характеризуется диффузным расположением хроматина в пространстве ядра, высокой транскрипционной активностью. Данными научной литературы подтверждается, что ооциты, извлеченные на данной стадии развития, завершают мейотическое созревание и могут быть оплодотворены, но развитие зиготы из NSN ооцита завершается на стадии двух бластомеров. SN конфигурация, напротив, отличается высокой степенью компактизации хроматина (что сопряжено с модификацией гистонов, присутствием факторов, ремоделирующих хроматин Brd7, Chd7), и, как следствие, пониженной транскрипционной активностью или полным ее отсутствием. Снижение уровня транскрипции связано с пониженной экспрессией генов транскрипционных факторов Gata3, Crebbp, Notch 1. Ранее показано, что SN ооциты являются наиболее крупными; они также успешно завершают мейотическое созревание и зиготы, полученные после оплодотворения in vitro, развиваются до стадии бластоцисты. Таким образом, SN ооциты обладают более высоким потенциалом к развитию и такой тип конфигурации ядра характерен для предовуляторных ооцитов. Конфигурация pSN является промежуточной, на данном этапе конденсирована только часть хроматина. Работы последних лет показали, что изучение состава ЯПТ важно для исследований в области клеточной биологии, биологии развития и медицины.

Разработан дополнительный критерий для оценки степени зрелости GV-ооцитов мышей - исследование механических свойств и взаимодействий компонентов зародышевого пузырька - ядерный мембраны, хроматина и ядрышка. В связи с тем, что биохимический состав ооцитов существенно меняется в процессе перехода от NSN к SN конфигурации, будут изменяться вязкостно-эластические свойства хроматина, а также механические характеристики ядрышка.

Метод оптических лазерных ловушек находит широкое применение в исследованиях биологических объектов, например, для изучения механических свойств ДНК-белковых комплексов. С использованием оптического пинцета можно удерживать объект, прикладывать силу (начиная от нескольких пиконьютонов), исследовать смещения объекта на расстояние от нескольких нанометров. Данный метод является малоинвазивным.

В дальнейшем разработанный способ будет раскрыт с использованием примера реализации.

Ооциты были получены от самок, возрастом 8-9 недель, линии С57B1/CBA путем пунктирования фолликулов в растворе PBS (Gibco, США). Ооциты, окруженные клетками кумулюса, помещались в каплю гиалуронидазы 10 мг/мл (Sigma, США). Затем ооциты переносили в раствор 100 мМ Hoechst 33342 (Molecular probes, Inc.) в среде M2 (Sigma, США), где они инкубировались в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего ооциты по одному переносились в каплю среды M2 ((Sigma, США) на покровном стекле и сверху закрывались еще одним покровным стеклом.

В ходе эксперимента использовали ооциты, находящиеся на стадии GV (germinal vesicle, GV), «зародышевый пузырек». Одной из важнейших особенностей GV-ооцитов является отсутствие в них типичных ядрышек - обязательных органелл соматических клеток, основной функцией которых является участие в биогенезе рибосом. Вместо ядрышек в GV-ооцитах присутствуют крупные (до 10 мкм в диаметре) сферические образования, получившие название «ядрышко-подобных» телец (ЯПТ).

Для создания оптической ловушки лазерное излучение предпочтительно фокусируют с использованием микроскопа.

В данной работе в мультиплексном лазерном манипуляторе использовали инвертированный оптический микроскоп (Olympus IX71). В поле микроскопа через объектив с высокой числовой апертурой заводили лазерное излучение. Использовали объективы ЛОМО МФЛЮАР 100×/1.3 или Olympus LCAch N 40×/0.55 Ph2. Сфокусированное излучение титан-сапфирового непрерывного лазера 790 нм в предметной плоскости, где находится исследуемый образец, выполняло роль "оптического пинцета". Параметры гауссовского пучка в поле микроскопа при NA=1.3 w₀=0.37 мкм, z₀=0.55 мкм и при NA=0.55 w₀=0.88 мкм, z₀=3.1 мкм. Коэффициент поглощения воды для этой длины волны пренебрежимо мал и составляет порядка 10^-9 см^-1. Пространственные манипуляции над ядрышкоподобными тельцами проводили путем их перемещения относительно фокального пятна при движении предметного столика. Перемещение предметного столика осуществляли либо "вручную" либо с использованием позиционных пьезодвигателей, причем, в последнем случае, обеспечивалась точность перемещений, близкая к десяти нанометрам. Визуальный контроль осуществляли с использованием видеокамеры (Sony ExwaveHAD).

Эксперимент проводили следующим образом. Фокус «оптического пинцета» наводился на край ядрышкоподобного тельца, в результате чего происходило втягивание центра тельца в центр фокуса (то есть происходило смещение тельца в пространстве) либо деформация ядрышкоподобного тельца. Полученное движение обрабатывалось и оцифровывалось по видеоизображениям, полученным в эксперименте. Использовали камеры, с частотой следования кадров от 25 до 1000 Гц. Было разработано программное обеспечение (ПО), позволяющее получать временные зависимости координат и степень несферичности различных составляющих объекта. В ПО были заложены различные функции фильтрации изображения: пороговые фильтры, гауссовые фильтры, билатеральные фильтры. В частности, применение фильтров позволяло получать качественные контуры исследуемых объектов, по которым оценивается несферичность объектов. Построение временных зависимостей координат в данном ПО осуществляли несколькими способами. Среди них метод сопоставления по шаблону, метод построения контуров. Для записанных треков предусматривалось вычитание движения объекта как целого, что позволяло изучать малые перемещения составляющих объекта (органелл, клеточных включений и т.д.).

Далее методом флуоренсцентной микроскопии определяли пространственную конфигурацию хроматина путем окрашивания ооцитов ДНК-связывающим красителей Hoechst 33342. На сегодняшний день различают два основных типа ооцитов по конфигурации хроматина - SN и NSN тип. Ооциты обоих типов завершают мейотическое созревание и могут быть оплодотворены, но развитие зиготы из NSN ооцита завершается на стадии двух бластомеров. SN конфигурация, напротив, отличается высокой степенью компактизации хроматина и, как следствие, пониженной транскрипционной активностью или полным ее отсутствием. Снижение уровня транскрипции связано, с пониженной экспрессией генов транскрипционных факторов Gata3, Crebbp, Notch 1. Ранее показано, что SN ооциты являются наиболее крупными; они также успешно завершают мейотическое созревание и зиготы, полученные после оплодотворения in vitro, развиваются до стадии бластоцисты. Таким образом, SN ооциты обладают более высоким потенциалом к развитию и такой тип конфигурации ядра характерен для предовуляторных ооцитов. Сравнительный анализ экспериментов показал, что в случае смещения центра ядрышкоподобного тельца данный ооцит относится к NSN типу. В случае же деформации тельца либо при полном отсутствии эффекта ооцит относится к SN типу.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предлагаемый способ позволяет воздействием лазерного облучения проводить успешное разделение ооцитов по распределению в них генетического материала хроматина.

Кроме того, дополнительным преимуществом разработанного способа следует признать высокую скорость проведения операции - операция занимает не более 2 мин без оптимизации отдельных стадий по времени, причем время операции может быть существенно сокращено за счет оптимизации.

Приведенный пример доказывает достижение указанного технического результата.