Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ ГРИБА EREMOTHECIUM ASHBYI - ПРОДУЦЕНТ ЭФИРНОГО МАСЛА С ЗАПАХОМ ЦВЕТКОВ РОЗЫ

Изобретение относится к биотехнологии, прикладной микробиологии и может быть использовано для применения в качестве продуцента эфирного масла. Целью изобретения является получение нового штамма гриба Eremothecium ashbyi Guill., синтезирующего эфирное масло с запахом цветков розы. Новый штамм Eremothecium ashbyi Guill. ВКПМ F-1320 является мутантом, селекционированным из популяции авторского штамма Eremothecium ashbyi ВКМ F-3009.

Изобретение относится к биологически чистой культуре штамма гриба Е. ashbyi ВКПМ F-1320, которая может быть использована в качестве продуцента эфирного масла с запахом цветков розы.

В настоящее время известны технологии получения индивидуальных душистых веществ с использованием микроорганизмов, способных как продуцировать их de novo, так и биоконвертировать из дополнительно введенных в питательную среду компонентов [1, 2]. За рубежом в производственных условиях осуществляются биотехнологии 4-декалактона с персиковым запахом (BASF), ванилина (Evolva), макроциклических компонентов мускуса (Nippon Mining Co., Quest International) [3, 4]. Однако производство смеси душистых соединений, в частности с запахом свежих цветков розы, не реализовано. Проведенные в 90-е годы прошлого века исследования Бугорского П.С., Семеновой Е.Ф. показали возможность получения ароматического продукта с запахом розы на основе штаммов Eremothecium ashbyi Guilliermond 1935 и Е. gossypii Kurtzman 1995 [5-8].

Предлагаемый штамм гриба Eremothecium ashbyi Guill. ВКПМ F-1320 новый, в научной и патентной литературе не описан. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту являются штамм гриба Eremothecium ashbyi ВКМ F-3009 - продуцент эфирного масла (А.с. 1454845 СССР) [5]. Однако по сравнению с прототипом при одинаковых условиях культивирования и выделения (экстракция гексаном) предлагаемый штамм отличается высокой продуктивностью эфирного масла (табл. 1, 2), в составе которого из монотерпеновых спиртов доминируют гераниол и цитронеллол, придающие ему запах цветков розы.

Идентификацию штамма ВКПМ F-1320 проводили на основе анализа последовательности 18S rRNA, а также по основным культурально-морфологическим признакам, физиолого-биохимическим свойствам согласно Определителю Kurtzman'a [11].

Для проверки чистоты культур был произведен посев коллекционного образца на агар Сабуро и инкубация его в течение 120 часов.

Морфология. Микроорганизм образует на твердой агаризованной среде плоские матовые (позднее глянцевые) колонии желтого цвета, легко снимающиеся с агара. Форма колоний округлая, диаметр 9-10 мм на картофельно-декстрозном агаре, 7-8 мм на сусло-агаре (через 3 суток роста при 28°C). Микроорганизм имеет дихотомически ветвящийся мицелий, состоящий из многоядерных клеток. Диаметр гиф варьирует в пределах 2,3-17,5 мкм. Спорангии продолговатые многоспоровые, конидии веретеновидные. Размеры аскоспор: длина 20,2-25,7 мкм, диаметр 2,4-2,8 мкм.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Оптимальная температура роста 25-28°C. Оптимум pH лежит в диапазоне 6,0…6,5. В качестве источников углерода и энергии использует глюкозу, сахарозу, не усваивает целлюлозу. Штамм синтезирует эфирное масло, которое обладает запахом, схожим с цветками розы, и содержит гераниол (43,1-51,4%), цитронеллол (0,0-1,9), ФЭС (43,7-61,4%). Селекционированный штамм Е. ashbyi отличается более высокой продуктивностью (табл. 1) и компонентным составом синтезируемого ароматического продукта от исходного штамма-прототипа (табл. 2).

Условия хранения штамма

Методы хранения: в пробирках на твердой скошенной агаризованной среде до 1 месяца при температуре 24°C, до 3 месяцев при температуре 5°C, до 5 лет под вазелиновым маслом.

Среды хранения: агар Сабуро (г/л: глюкоза - 40,0; пептон - 10,0; агар-агар - 18,0-20,0); глюкозо-пептонный агар с дрожжевым экстрактом (г/л: глюкоза - 10,0-30,0; пептон - 2,0-10,0; дрожжевой экстракт - 0,5-3,0; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-пептонный агар (г/л: мальт-экстракт - 15,0-30,0; пептон - 1,0-4,0; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-агар (г/л: солодовое сусло (3,5°Б) - 1,0 л; агар-агар - 18,0-20,0); картофельно-глюкозный агар (г/л: картофель - 200,0; глюкоза - 1,0-10,0; агар-агар - 18,0-20,0); соево-сахарозный агар (г/л: сахароза - 10,0-30,0; соевая мука - 10,0-40,0; агар-агар - 18,0-20,0).

Среды культивирования

Твердые: агар Сабуро (г/л: глюкоза - 40,0; пептон - 10,0; агар-агар - 18,0-20,0); глюкозо-пептонный агар с дрожжевым экстрактом (г/л: глюкоза - 10,0-30,0; пептон - 2,0-10,0; дрожжевой экстракт - 0,5-3,0; гидроортофосфат калия - 0,0-0,5; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-пептонный агар (г/л: мальт-экстракт - 15,0-30,0; пептон - 1,0-4,0; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-агар (г/л: солодовое сусло (3,5°Б) - 1,0 л; агар-агар - 18,0-20,0); картофельно-глюкозный агар (г/л: картофель - 200,0; глюкоза - 1,0-10,0; агар-агар - 18,0-20,0); соево-сахарозный агар (г/л: сахароза - 10,0-30,0; соевая мука - 10,0-40,0; агар-агар - 18,0-20,0); рисовый агар (г/л: обезвоженные рисовые хлопья - 20,0; глюкоза - 10,0-20,0; агар-агар - 15,0-20,0);

Жидкие: соево-сахарозная (г/л: соевая мука - 10,0-30,0, сахароза - 10,0-35,0); солодовый бульон с дрожжевым экстрактом (г/л: экстракт солода - 5,0-15,0, мальтоза - 5,0-10,0, дрожжевой экстракт - 0,5-2,0, глюкоза - 7,5-15,0, пептон - 3,0-10,0, гидроортофосфат калия - 0,0-0,5); глюкозо-пептонная (г/л: глюкоза - 7,5-15,0, пептон - 2,0-10,0, натрия сукцинат - 1,0-2,5, калия гидроортофосфат - 0,0-1,0, инозит - 0,0-0,5).

Температура и время культивирования: 25-28°С, 7 суток.

Использование штамма иллюстрируется следующим примерами.

Пример 1. Штамм выращивали в течение 5 суток при 28°С в пробирках на скошенной агаризованной среде следующего состава (г/л): глюкоза - 10,0, пептон - 3,0, дрожжевой экстракт - 0,5, гидроортофосфат калия - 0,5, агар-агар - 20,0, вода дистиллированная - до 1 л. Для образования и накопления эфирного масла вносили клеточную суспензию в изотоническом растворе, соответствующую стандарту мутности 2, в количестве 2% в колбы с жидкой питательной средой следующего состава (г/л): экстракт солода - 6,0, мальтоза - 6,0, дрожжевой экстракт - 1,2, глюкоза - 13,5, пептон - 4,0, гидроортофосфат калия - 0,5, вода дистиллированная - до 1 л. Инкубирование осуществляли при 28°С на качалке (150 об/мин) в течение 120 часов. Эфирное масло экстрагировали гексаном. Количество ароматического продукта составило 181,1 мг/л. Состав ароматоообразующих соединений, мас.%: гераниол 43,8, цитронеллол 1,9, β-фенилэтанол 51,4, а также идентифицированы линалоол, фарнезол, нераль и гераниаль.

Пример 2. Штамм выращивали в течение 6 суток при 28°С в пробирках на скошенной агаризованной среде следующего состава (г/л): глюкоза - 10,0, пептон - 3,0, дрожжевой экстракт - 0,5, гидроортофосфат калия - 0,5, агар-агар - 20,0, вода дистиллированная - до 1 л. Для получения посевного материала вносили клеточную суспензию в изотоническом растворе, соответствующую стандарту мутности 1, в количестве 1% в пробирки с жидкой глюкозо-пептонной питательной средой и помещали при 28°С на качалку (180 об/мин). Засев 24-часовым инокулятом (5% по объему) проводили в бульон с экстрактом солода. Инкубирование осуществляли при 28°С на качалке (220 об/мин) в течение 59 часов. Эфирное масло экстрагировали гексаном. Количество ароматического продукта достигло 272,0 мг/л. Состав ароматообразующих соединений, мас.%: гераниол 46,85, цитронеллол 1,36, β-фенилэтанол 54,75.

Пример 3. Штамм выращивали в течение 7 дней при 28°С в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре. Культуру использовали для получения инокулята. Засев проводили в жидкую питательную среду следующего состава (г/л): глюкоза - 10,0, пептон - 3,0, дрожжевой экстракт - 0,5, натрия сукцинат - 1,5, калия гидроортофосфат - 0,5, инозит - 0,14, вода дистиллированная - до 1 л. Культивировали при 28°C в течение 48 часов на качалке (220 об/мин). Для образования и накопления эфирного масла инокулят в количестве 5% вносили в биореактор (10 л) с жидкой питательной средой следующего состава (г/л): соевая мука - 20,0, сахароза - 20,0, воды дистиллированной до 1 л. Культивирование осуществляли в течение 48 часов при 28°C, 600 об./мин., аэрации 500 л/ч. Эфирное масло экстрагировали гексаном. Количество ароматического продукта достигло 336,1 мг/л. Состав ароматообразующих соединений, мас.%: гераниол 48,38, цитронеллол 1,31, β-фенилэтанол 50,44.

Список литературы

1. Krings, U. Biotechnological production of flavours and fragrances / U. Krings, R.G. Berger // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1998. - V. 49. - P. 1-8.

2. Biotechnological production of bioflavors and functional sugars / J.L. Bicas, J.C. Silva, A.P. Dionisio, G.M. Pastore // Ciencia e Technologia de Alimentos. - 2010. - V. 30, №1. - P. 7-18.

3. Production of flavours by microorganisms / L. Janssens, H.L. De Pooter, N.M. Schamp, E.J. Vandamme // Process Biochemistry. - 1992. - V. 27. - P. 195-215.

4. Bomgardner, M.M. The sweet smell of microbes / M.M. Bomgardner // Chemical & Engineering News. - 2012. - V. 90, №29. - P. 25-29.

5. A.c. 1454845 СССР Штамм гриба Eremothecium ashbyi - продуцент эфирного масла / Семенова Е.Ф., Родов B.C., Бугорский П.С. (СССР) Заявл. 28.07.87 (заявка №4291537 с датой приоритета изобретения 28.07.1987 г.). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 01.10.1988 г. Опубл. 30.01.89, БИ №4.

6. А.с. 1794948 СССР Штамм гриба Ashbya gossypii - продуцент эфирного масла / Семенова Е.Ф., Бугорский П.С., Радзимовская С.Б. (СССР). Заявл. 23.08.90 (заявка №4862283 с датой приоритета изобретения 23.08.1990 г.). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 08.10.1992 г. Опубл. 15.02.93, БИ №6.

7. А.с. 1421765 СССР Способ получения смеси душистых веществ, обладающей запахом розы / Бугорский П.С., Семенова Е.Ф., Родов B.C., Миронов В.А. (СССР) Заявл. 22.05.87 (заявка №4246910 с датой приоритета изобретения 22.05.1987 г.). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 08.05.1988 г. Опубл. 07.09.88, БИ №33.

8. А.с. 1698276 СССР Способ получения ароматического продукта с запахом розы / Семенова Е.Ф., Бугорский П.С. (СССР). Заявл. 20.07.88 (заявка №4600171 с датой приоритета изобретения 20.07.1988 г.). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 15.08.1991 г. Опубл. 15.12.91, БИ №46.

9. The yeast, a taxonomic study. Ed. by Kurtzman CP. Fell J.W. Fourth Edition. - Elsevier Science, 1998. - 1055 p.