Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ ЦЫПЛЯТ "МЕ-77" ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ИНАКТИВИРОВАННЫХ СОРБИРОВАННЫХ И ЭМУЛЬГИРОВАННЫХ ВАКЦИН И ДИАГНОСТИКУМОВ

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к штамму вируса инфекционной анемии цыплят, и может быть использовано для конструирования и производства инактивированных сорбированных и эмульгированных вакцин и средств для лабораторной диагностики инфекционной анемии цыплят.

Инфекционная анемия цыплят (ИАЦ) - вирусная, иммунодефицитная болезнь цыплят и субклиническая инфекция кур [2, 5], характеризующаяся отставанием в росте и развитии, анемией, дерматитами, повышенной восприимчивостью к возбудителям других инфекций (вирусных, бактериальных, паразитарных), а также снижением эффективности вакцинаций против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, инфекционной бурсальной болезни и др. [3]. Впервые болезнь была выявлена в 1979 году в Японии [4, 7, 12, 13] у цыплят, вакцинированных против болезни Марека вакциной, контаминированной вирусом ИАЦ [4, 9, 11, 13].

Вирус ИАЦ широко распространен во всех странах мира с развитым птицеводством [6, 8]. По результатам мониторинговых исследований сывороток крови с использованием метода иммуноферментного анализа (ИФА) установлено, что в Российской Федерации количество сероположительных проб составляет 10-100%, в том числе у птицы старше 150-суточного возраста антитела выявляются в 94-100% случаев, у птицы в возрасте до 60-суточного возраста - в 65-90% случаев [1].

Экономический ущерб от ИАЦ складывается из потерь за счет ухудшения производственных показателей сохранности и продуктивности птицы, снижения эффективности специфической профилактики, повышения затрат на антибактериальные препараты для купирования секундарных инфекций, развивающихся на фоне ИАЦ, а также за счет снижения качества мясной продукции.

В Российской Федерации болезнь официально не регистрируется. Нормативные документы по профилактике и мерам борьбы, средства специфической профилактики не разработаны. Для детекции и типирования возбудителя используются полимеразно-цепная реакция (ПЦР) и геномное сиквенирование, а также электронная микроскопия. Отечественная ветеринарная вирусология не располагает штаммом вируса ИАЦ, пригодного для создания средств специфической профилактики болезни.

Известен ряд штаммов вируса ИАЦ, используемых для производства вакцин и диагностикумов. Это - «CUX-1» (штамм вируса ИАЦ, репродуцируемый в СПФ-куриных эмбрионах 5-6-суточного возраста) [10] и «26Р4» (штамм вируса ИАЦ, адаптированный к культуре лимфобластоидных клеток MDCC-MSB1) [15].

Однако данные штаммы являются аттенуированными и имеют более низкую антигенную активность по сравнению с эпизоотическим штаммом.

В качестве прототипа выбран известный штамм «АБИМ», предназначенный для производства диагностикумов [14].

Этот штамм имеет более низкую антигенную активность и может быть использован только при разработке средств для лабораторной диагностики ИАЦ.

Задачей изобретения является получение высоковирулентного штамма вируса инфекционной анемии цыплят, обладающего стабильной вирулентностью для восприимчивой птицы, выраженной антигенной и иммуногенной активностью, пригодного для использования в производстве инактивированных сорбированных и эмульгированных вакцин и средств для лабораторной диагностики инфекционной анемии цыплят.

Поставленная задача достигается штаммом «МЕ-77» вируса инфекционной анемии цыплят, полученным путем выделения изолята вируса инфекционной анемии цыплят из печени клинически больных цыплят-бройлеров из промышленного птицеводческого хозяйства ООО «Торгово-птицеводческая компания «Балтптицепром» (г. Калининград). Штамм «МЕ-77» вируса инфекционной анемии цыплят вызывал проявление характерных клинических и патологоанатомических признаков, гибель цыплят, у выживших цыплят - выраженную сероконверсию в высоких титрах. Проведено 5 пассажей на развивающих СПФ-куриных эмбрионах 4-5-суточного срока инкубации при заражении в желточный мешок и инкубации при 37°С в течение 14 суток с последующим заражением суточных цыплят и изучением клинических и патологоанатомических характеристик.

Штамм «МЕ-77» депонирован в Государственную коллекцию вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России 20 декабря 2016 года под регистрационным номером 2837.

Штамм «МЕ-77» вируса ИАЦ поддерживается последовательными пассажами на суточных цыплятах, свободных от специфических антител. Штамм относится к семейству Circoviridae, роду Gyrovirus, обладает выраженной инфекционной и антигенной активностью. Штамм может быть использован для производства инактивированных сорбированных и эмульгированных вакцин и средств для лабораторной диагностики инфекционной анемии цыплят.

Штамм «МЕ-77» отличается от штаммов «CUX-1» и «26Р4» тем, что является эпизоотическим патогенным штаммом. По сравнению со штаммом «АБИМ» штамм «МЕ-77» является более вирулентным и, следовательно, более иммуногенным. Штамм «МЕ-77» вируса ИАЦ характеризуется следующими признаками и свойствами:

Морфологические свойства

При исследовании методом электронной микроскопии (негативное контрастирование) установлено, что штамм «МЕ-77» вируса ИАЦ имеет размер вирионов 18-22 нм, форма вириона икосаэдрическая.

При молекулярно-генетическом исследовании с использованием прямого tctcatgaacgctctccaagaagata и обратного tctggatcccagtcttatacaccttcttgc праймеров установлено, что штамм «МЕ-77» вируса ИАЦ относится к ДНК-содержащим вирусам, имеет гомологию 89% с изолятом CNBR-37 и штаммами JS-China 78, AN-China 32.

Штамм устойчив к ионным и неионным детергентам и органическим растворителям, нагреванию при температуре 60°С в течение 30 мин - 1 ч; формальдегид инактивирует вирус в 5%-ной конечной концентрации за 24 часа при комнатной температуре.

Патогенные и антигенные свойства

Экспериментально установлено, что внутримышечное или внутрибрюшинное введение вируса в объеме 0,2 мл СПФ-цыплятам суточного возраста вызывает у цыплят на 8-12 сутки после инокуляции существенное отставание в росте, угнетение, бледность гребня, клюва, нижних конечностей и гибель до 30%.

При патологоанатомическом вскрытии у павших цыплят отмечаются истощение, бледность кожного покрова, слизистых оболочек и паренхиматозных органов, апластическая анемия костного мозга, атрофия тимуса и фабрициевой сумки, внутримышечные кровоизлияния.

Уровень гематокрита в крови у цыплят опытной группы снижен до 14% при норме 41%.

Для получения моноспецифической сыворотки СПФ-цыплятам 15-суточного возраста подкожно в области шеи 2-кратно с интервалом 15-20 суток вводили штамм «МЕ-77» вируса инфекционной анемии цыплят в объеме 1,0 см³.

Сыворотку крови цыплят получают через 21 день после повторного ведения штамма «МЕ-77» вируса ИАЦ. Активность сыворотки в ИФА на наборах Biochek достигает 1:7503. Специфичность иммунной реакции подтверждена при исследовании сыворотки крови экспериментально зараженных цыплят в ИФА на наличие антител к гетерологичным возбудителям.

Контроль стерильности штамма «МЕ-77» проверяли путем посева на питательные среды МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, Сабуро и Эдварда. В течение срока наблюдения (10 суток) питательные среды оставались стерильными, что свидетельствовало об отсутствии контаминации штамма «МЕ-77» вируса ИАЦ бактериальной, грибной микрофлорой и микоплазмами.

При заражении СПФ-куриных эмбрионов штаммом «МЕ-77» вируса ИАЦ в аллантоисную полость, в желточный мешок, на хориоалантоисную оболочку специфическая гибель СПФ-эмбрионов кур и какие-либо характерные признаки поражения отсутствовали, что свидетельствовало об отсутствии контаминации чужеродными вирусами.

Вирус реплицируется и накапливается: в СПФ-эмбрионах кур 5-6-суточного срока инкубации без выраженной гибели и патологических изменений; в культуре лимфомы яичника курицы MDCC-MSB1, вызывая специфическое цитопатическое действие (разрушение ядра и деградация клеток); в печени и других лимфоидных органах суточных СПФ-цыплят, вызывая отставание в росте, апластическую анемию и атрофию лимфоидных органов и гибель до 30%. Репликация и накопление вируса подтверждена при помощи качественного и количественного анализа в ПЦР в реальном времени.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1

Получение моноспецифической сыворотки

Для получения моноспецифической сыворотки СПФ-цыплятам 15-суточного возраста подкожно в области шеи вводили вируссодержащий материал, содержащий штамм «МЕ-77» вируса инфекционной анемии цыплят в объеме 1,0 см³. При введении живого вируса в организм цыпленка, имеющего антитела к вирусу ИАЦ, происходит элиминация вируса антителами и, соответственно не повышение, а снижение титра антител. Поэтому через 21 день цыплятам подкожно в области шеи вводили инактивированный вируссодержащий материал, содержащий штамм «МЕ-77» вируса инфекционной анемии цыплят в объеме 1,0 см^3.

^{Сыворотку крови цыплят получают через 21 день после повторного ведения штамма «МЕ-77» вируса ИАЦ. Активность сыворотки в ИФА на наборах Biochek достигает 1:7503. Специфичность иммунной реакции подтверждена при исследовании сыворотки крови экспериментально зараженных цыплят в ИФА на наличие антител к гетерологичным возбудителям: вирусу ньюкаслской болезни, вирусу инфекционной бурсальной болезни, вирусу инфекционного бронхита кур, метапневмовирусу, вирусу инфекционного ларинготрахеита, реовирусу.}

Пример 2.

Экспериментальная вакцинация с использованием инактивированной вакцины против ИАЦ

СПФ-цыплятам 28-суточного возраста вакцинировали подкожно в области шеи инактивированной эмульгированной вакциной против ИАЦ. Вакцина была приготовлена из тканевого гомогената, штамма «МЕ-77». Вакцину СПФ-цыплятам подкожно в области шеи вводили в объеме 1 см³. Через 28 суток после вакцинации от вакцинированных цыплят и цыплят контрольной группы отбирали сыворотки крови и исследовали в ИФА с использованием набора Biochek. Средний титр сыворотки крови, полученной от вакцинированных цыплят, составил от 1:7239 до 1:8749. Все сыворотки крови, полученные от цыплят контрольной группы, были серонегативными. Результаты исследований демонстрируют, что инактивированная вакцина, содержащая штамм «МЕ-77», способна индуцировать иммунный ответ у инокулированного животного.

Таким образом, полученный штамм «МЕ-77» вируса инфекционной анемии цыплят обладает стабильной вирулентностью для восприимчивой птицы, выраженной антигенной и иммуногенной активностью, пригоден для использования в производстве инактивированных сорбированных и эмульгированных вакцин и средств для лабораторной диагностики инфекционной анемии цыплят.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Алиев А.С. Инфекционная анемия цыплят / А.С. Алиев, К.В. Зимин, Н.Ю. Серова // БИО. - 2011. - № (124/125). - С. 6-12.

2. Бакулин В.А. Болезни птиц / В.А. Бакулин. - СПб.: ОАО «Издательское полиграфическое предприятие «Искусство России», 2006. - 688 с.

3. Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц / Под ред. Б.У. Кэлнека, X. Джона Барнса, Чарльза У. Биэрда и др. (Edited by B.W. Calnek et al.). Пер. с англ. - 10-е изд. - М.: АКВАРИУМ БУК, 2003. - 1232 с. + 32 с. вкл., ил.

4. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев и др. - М.: ВНИТИБП, 1998. - 928 с, ил.

5. Дмитриева М.Е. Инфекционная анемия цыплят. Диагностика и профилактика / М.Е. Дмитриева, Э.Д. Джавадов, Е.С. Людькова. - СПБ.: РК «Агат», 2011. - 40 с.

6. Дмитриева М.Е. Инфекционная анемия цыплят и качество мяса бройлеров / М.Е. Дмитриева // Птица и птицепродукты. - 2016. - №4. - С. 48-49.

7. Инфекционная патология животных: в 2 т./ А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Е.А. Непоклонов и др. Под ред. А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьева, Е.А. Непоклонова, Е.С. Воронина. - М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. - Т. 1. - 1911 с.

8. Bulow, V.v. Chicken infectious anemia / Bulow V.v. // Crit. Rev. Poult. Biol. - 1991. - V. 3. -P. 1-17.

9. Taniguchi, T. Pathological changes in chickens inoculated with reticuloendotheliosis - virus contaminated Marek's disease vaccine / Taniguchi Т., Yuasa N., Sato S. // Natl. Inst. Anim. Health. Q. - 1977. - V. 17. - P. 141-150.

10. Vielits E. Anemia in broilers: development of a vaccine for parent stock / Vielits E., Bulow V.v., Landgraf H., Conrad C. // J. Vet. Med. - 1987. - V. 34. - P. 553-557.

11. Yuasa N. Isolation and some characteristics of an agent inducing anemia in chicks / Yuasa N.. Taniguchi Т., Yoshida I. // Avian Dis. - 1979. - V. 23. - P. 366-385.

12. Yuasa N. Pathogenocity and antigenicity of eleven isolated of chicken anemia agent (CAA) / Yuasa N. Imai K. // Avian Pathol. - 1986. - V. 15. - P. 639-645.

13. Yuasa, N. Efficacy of Marek's disease vaccine, herpesvirus of turkeys, in chickens infected with chicken anemia agent / Yuasa N., Imai K. // in S. Kato, T. Horincki, T. Mikami, and K. Hirai (eds.). Advances in Marek's Disease Reseach, Japanese Association on Marek's Disease, Osaka, Japan. - 1988. - P. 358-363.

14. Патент RU 2489487 C1 C12N 7/00, A61К 39/12, 10.08.2013.

15. United States Patent. Chicken anaemia agent vaccine / C.C. Schrier, 1998.