Результат интеллектуальной деятельности: АПТАМЕРЫ, СПЕЦИФИЧНЫЕ К ВНЕКЛЕТОЧНОМУ ГЛИКОЗИЛИРОВАННОМУ ДОМЕНУ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО РЕЦЕПТОРА CD47

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к ДНК аптамерам, представляющим собой олигодезоксирибонуклеотиды, включающие модифицированные и немодифицированные азотистые основания и обладающие способностью блокировать взаимодействие клеточного рецептора CD47 с его природным лигандом SIRPa, что может служить основой для создания лекарств, используемых в противоопухолевой терапии.

В настоящее время одной из наиболее изучаемых областей молекулярной биологии клетки является влияние поверхностных клеточных рецепторов на развитие и прогрессию онкологических заболеваний. В общем смысле клеточные рецепторы представляют собой группу интегральных мембранных белков, внеклеточная часть которых, как правило, содержит гликозилированный домен. Благодаря своей уникальной пространственной структуре каждый из рецепторов способен взаимодействовать с различными молекулами - лигандами. В качестве лигандов могут выступать такие соединения, как гормоны, цитокины, ростовые факторы, нейротрансмиттеры, молекулы адгезии и др., взаимодействие с ними приводит к изменению пространственной структуры рецептора, что служит своеобразным механизмом передачи сигнала в клетку и запускает различные сигнальные каскады. В результате происходит изменение метаболизма и активности клетки в ее макроокружении, таким образом, в норме обеспечивается гомеостаз клеток и организма в целом. Однако при трансформации происходят различные нарушения, связанные с изменением активности экспрессии различных генов, в том числе поверхностных рецепторов. В результате, некоторые рецепторы перестают синтезироваться вовсе, а некоторые подвергаются гиперэкспрессии, происходит локальное нарушение гомеостаза. Зачастую изменения такого рода обеспечивают опухолевым клеткам хорошую маскировку и позволяют уходить от иммунного ответа или даже мобилизовать клетки иммунной системы для своей защиты.

На сегодняшний день свойства некоторых рецепторов уже хорошо изучены и появляются первые терапевтические препараты, позволяющие подавить эффект их влияния на прогрессию опухолевых клеток. Одним из таких рецепторов является клеточный гликопротеин CD47. Как известно, в норме CD47 играет роль в межклеточных взаимодействиях, предотвращая захват нормальных эритроцитов фагоцитарными клетками. Также CD47 является рецептором SIRP-alpha, связывание с которым блокирует созревание незрелых дендритных клеток и ингибирует образование цитокинов незрелыми дендритными клетками. Однако в трансформированных клетках гиперэкспрессия CD47 и его взаимодействие с SIRP-alpha позволяет также избежать фагоцитоза. Таким образом, блокировка взаимодействия CD47 с его природным лигандом SIRP-alpha позволит запустить механизм врожденного иммунитета и будет способствовать элиминации опухолевых клеток из организма.

В современной практике для такого рода терапии обычно используются моноклональные и поликлональные антитела. К сожалению, физические особенности антител накладывают определенные ограничения на их применение в практике. Поликлональные антитела получаются in vivo путем иммунизации, что ограничивает возможности их селекции из-за низкой иммуногенности многих мишеней, непредсказуемой аффинности и специфичности, дорогостоящего процесса производства, большого размера антител (по сравнению с аптамерами), их иммуногенностью и малой способностью проникать внутрь клеток и тканей, а также неустойчивостью во многих средах. Моноклональные антитела более специфичны, однако имеют достаточно большие размеры, что в значительной степени сказывается на их иммуногенности и способности активно проникать внутрь тканей. В свою очередь технологии отбора специфичных антител достаточно трудоемки и требуют значительного количества ресурсов и времени. Данные проблемы могут быть преодолены с использованием технологии аптамеров, в частности ДНК аптамеров. Аптамеры представляют собой короткие одноцепоченые олигонуклеотиды, способные специфически связываться с определенными мишенями. За счет своих малых размеров аптамеры обладают крайне низкой иммуногенностью и высокой способностью проникать в любые ткани и клетки. Отбор специфичных к мишени аптамерных молекул достаточно прост и занимает значительно меньше времени относительно времени получения моноклональных антител. ДНК аптамеры также демонстрируют хорошую стабильность даже в агрессивных условиях. С другой стороны, структура аптамеров позволяет вводить модифицированные основания, что значительно расширяет диапазон возможных вариантов (до 10¹⁵ возможных молекул), а следовательно, появляется возможность подобрать максимально аффинную молекулу.

Таким образом, использование в анти-CD47 терапии аптамерных молекул, обладающих высоким сродством к области контакта с SIRP-alpha, позволяет решить многие проблемы, возникающие при использовании моно- и поликлональных антител.

На сегодняшний день описаны полипептиды, антитела или фрагменты антител, специфичные к различным вариантам лиганда CD47, в том числе обладающие блокирующим действием в отношении взаимодействия CD47 и его естественного лиганда SIRPalpha, пригодные для проведения иммунотерапии (международные заявки WO 2010083253, WO 2013004842, WO 2013119714).

Однако среди аналогов не обнаружено аптамерных соединений, представляющих собой модифицированные либо немодицфицированные молекулы нуклеиновых кислот (ДНК либо РНК), обладающих высоким сродством к внеклеточной части рецептора CD47 либо способных блокировать взаимодействие CD47 и SIRP-alpha.

Задачей настоящего изобретения является получение аптамеров, специфичных к внеклеточному гликозилированному домену человеческого рецептора CD47, способных блокировать его взаимодействие с природным лигандом SIRPa.

Задача решается новыми молекулами аптамеров. Настоящее изобретение включает в себя два типа аптамерных молекул, способных специфично связываться с гликозилированным внеклеточным доменом рецептора CD47 и блокировать его взаимодействие с природным лигандом SIRPa.

К первому типу относятся две немодифицированные аптамерные молекулы общего вида:

1. ATACCAGCTTATTCAATTCCCGACCCAAGATT

GTACCGCGGCCAACGTCACACGGGCAAGTCCAGACATTT

AAGATAGTAAGTGCAATCT- SEQ ID NO: 1

2. ATACCAGCTTATTCAATTCCCCGGTTCACTGGT

TGTAGAATCCGGCCGAGCAAACTCTTCGTAATCGAGCAG

AGATAGTAAGTGCAATCT- SEQ ID NO: 2

Каждый аптамер представляет собой 90-звенный олигонуклеотид с молярным содержанием гуанин-цитозиновых пар - 46% и 47% соответственно.

Ко второму типу относятся две модифицированные аптамерные молекулы общего вида:

1. TACCAGCTTATTCAATTTCGGGTGGGCGCTCA

CCACCCCATAGTGCGTATGACCACGAAAACCCAAGAGGA

AGATAGTAAGTGCAATCT - SEQ ID NO: 3.

2. ATACCAGCTTATTCAATTATTGAACCCACAAC

TTCCTGCCGCTGCCAGACTTGCGTGAGCTGAGGACGCAT

TAGATAGTAAGTGCAATCT- SEQ ID NO: 4

Каждый аптамер представляет собой 90-звенный олигонуклеотид с молярным содержанием гуанин-цитозиновых пар - 46% и 48% соответственно. Остатки тимина, входящего в структуру аптамера, представляют собой производные замещенного дезоксиуридинтрифосфта, содержащего линкерную группу, меченную фрагментом бороновой кислоты.

Включение модифицированного основания позволяет значительно расширить репертуар библиотеки и отобрать наиболее мишень-специфичные варианты аптамеров. Кроме того, в связи с тем, что основной задачей данного изобретения являлось получение аптамеров, обладающих специфичностью к внеклеточному гликозилированному домену рецептора CD47, введение модифицированных нуклеотидов данного типа позволило увеличить специфичность аптамерных молекул по отношению к гликозилированным остаткам рецептора. Также, исходя из этого, в качестве функциональной группировки модифицированного нуклеотида были предложены соединения бороновой кислоты. Особенностью бороновых кислот является их способность связываться с гидроксильными группами и диолами, входящими в состав полисахаридов, добавляемых к поверхностным белкам клетки в процессе гликозилирования.

Модифицированное основание данного типа было получено в результате реакции азид-алкинового присоединения (реакция Хьюсгена) между коммерчески доступным модифицированным 5'-этинилдезоксиуридинтрифосфатом и азидным производным 4-аминофенилбороновой кислоты в присутствии каталитического количества ионов одновалентной меди.

Для этого водный раствор исходного нуклеозидтрифосфата смешивают с раствором 2-азид-4-аминофенилбороновой кислоты и прибавляют раствор бромида меди (I), содержащий также вспомогательный лиганд ТВТА (трис[(1-бензил-1Н-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амин). После выдерживают в течение 2-5 часов (контроль по ВЭЖХ) и выделяют продукты реакции с помощью препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Ключевым требованием, предъявляемым к таким модифицированным дезоксинуклеозидтрифосфатам, является их способность участвовать в полимеразной цепной реакции на всех стадиях - как в качестве строительного материала для новой цепи ДНК, так и в составе матричной цепи для построения новой. Наибольшей эффективностью встраивания модифицированных оснований обладает термостабильная высокоточная ДНК-зависимая ДНК полимераза Deep Vent.

В дальнейшем, описанные выше аптамерные молекулы были получены путем селекции библиотеки немодифицированных олигонуклеотидов методом SELEX. Принцип метода SELEX заключается проведении нескольких раундов отбора синтезированной библиотеки олигонуклеотидов по их способности связываться с мишенью. Каждый раунд включает в себя несколько стадий:

1) библиотеку олигонуклеотидов инкубируют с молекулой-мишенью;

2) комплексы олигонуклеотидов, связавшиеся с мишенью, отделяют от не связавшихся олигонуклеотидов;

3) проводят амплификацию связавшихся с мишенью олигонуклеотидов.

Результатом такого отбора становится постепенное обогащение библиотеки олигонуклеотидами, имеющими повышенное сродство к молекуле-мишени.

Все аптамеры, принадлежащие к двум типам, по изобретению:

- обладают высоким уровнем специфичности к внеклеточному гликозилированному домену человеческого рецептора CD47;

- блокируют взаимодействие рецептора CD47 с его природным лигандом SIRP-alpha;

- достаточно устойчивы к действию агрессивных сред, что позволяет использовать данные аптамеры в виде суспензионных растворов вводимых в кровеносное русло.

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:

Фиг. 1 - график сравнения эффективности аптамерных молекул, полученных из немодифицированной библиотеки, на способность блокировать взаимодействие между CD47 и SIRP-alpha. График построен по результатам конкурентного иммуноферментного анализа. По оси X - номера клонов, по оси Y - оптическая плотность (измеряется в абсолютных единицах).

Фиг. 2 - график сравнения эффективности аптамерных молекул, полученных из модифицированной бибилотеки, на способность блокировать взаимодействие между CD47 и SIRP-alpha. График построен по результатам конкурентного иммуноферментного анализа. По оси X - номера клонов, по оси Y - оптическая плотность (измеряется в абсолютных единицах).

Фиг. 3 - звисимость количества SIRP-alpha от количества внесенного ДНК-аптамера, результаты измерений для немодифицированных аптамеров.

Фиг. 4 – зависимость количества SIRP-alpha от количества внесенного ДНК-аптамера, результаты измерений для модифицированных аптамеров.

ATACCAGCTTATTCAATTCCCGACCCAAGATTGTACCGCGGCCAACGTCACACGGGCAAGTCCAGACATTTAAGATAGTAAGTGCAATCT

ATACCAGCTTATTCAATTCCCCGGTTCACTGGTTGTAGAATCCGGCCGAGCAAACTCTTCGTAATCGAGCAGAGATAGTAAGTGCAATCT

TACCAGCTTATTCAATTTCGGGTGGGCGCTCACCACCCCATAGTGCGTATGACCACGAAAACCCAAGAGGAAGATAGTAAGTGCAATCT

TACCAGCTTATTCAATTTCGGGTGGGCGCTCACCACCCCATAGTGCGTATGACCACGAAAACCCAAGAGGAAGATAGTAAGTGCAATCT