Результат интеллектуальной деятельности: Штамм вируса болезни Ньюкасла NDVH-2 для изучения возможности разработки на его основе вирусного онколитического препарата

Область техники

Настоящее изобретение относится к штамму Н вируса болезни Ньюкасла, а именно к штамму NDVH-2, инфицирующему и лизирующему опухолевые клетки человека in vitro, перспективного для разработки на его основе вирусного онколитического препарата для терапии злокачественных новообразований человека, и может быть использовано в медицинской вирусологии, биотехнологии и микробиологии.

Уровень техники

На сегодняшний день онкологические заболевания остаются одной из главных причин смертности среди населения экономически развитых стран. По прогнозам ВОЗ ежегодное число смертей от рака будет только расти и к 2030 году достигнет 13 миллионов случаев в год [World Health Organization (WHO). World Health Statistics 2012. Geneva: WHO. Euro Surveill. - 2012. Vol. 17(20). Available from: http://www.who.int/gho/publications/world_health_statistics/EN_WHS2012_Full.pdf].

Основными методами лечения онкологических больных остаются хирургическое удаление опухоли, химиотерапия и лучевая терапия, причем в подавляющем большинстве случаев их приходится комбинировать. Применяемые методики лечения зачастую являются не эффективными или приводят к значительному снижению качества жизни пациентов в силу воздействия на здоровые ткани пациентов. В последние годы большие надежды возлагаются на разработку таргетных подходов терапии опухолей, использующих онколитические вирусы [Gubanova N.V., Gaytan A.S., Razumov I.A., Mordvinov V.A., Krivoshapkin A.L., Netesov S.V., Chumakov P.M. Oncolytic viruses in the therapy of gliomas // MolBiol+. - 2012. - Vol. 46. - Р. 780-789]. О целесообразности применения виротерапии для лечения злокачественных новообразований свидетельствует селективность вирусов к неопластическим клеткам с минимальной токсичностью для нормальных здоровых тканей, а также эффективная репликация вирусных частиц, уничтожение трансформированных клеток и распространение вирусного потомства на соседние опухолевые клетки. Помимо непосредственного лизиса раковых клеток, онколитические вирусы способны вызывать иммунный ответ организма посредством стимулирования адаптивного и врожденного иммунитета [Юрченко К.С., Губанова Н.В., Шестопалова Л.В., Щелканов М.Ю., Шестопалов A.M. Онколитические свойства вируса болезни Ньюкасла // Тихоокеанский Медицинский Журнал. - 2015. - №3. - С. 14-19].

В настоящее время описан широкий круг вирусов, используемых для виротерапии злокачественных новообразований. На данный момент в США, Канаде, Китае и странах Европы (Германия, Венгрия) в клинических испытаниях протестирован ряд штаммов ВБН на наличие у них противоопухолевого потенциала (PV701, LaSota, МТН-68, 73-Т, HUJ и Ulster). Проведенные исследования продемонстрировали безопасность используемых штаммов, несмотря на разницу в патогенных характеристиках штаммов. Многие исследованные штаммы демонстрируют онколитический эффект при интратуморальном введении, но менее эффективны при внутривенной инъекции. Было продемонстрировано, что при внутривенном введении большая часть вирусов практически моментально удаляется из кровотока ретикулоэндотелиальной системой печени и селезенки [Breitbach C.J., Burke J., Jonker D., Stephenson J., Haas A.R., Chow L.Q.M., Nieva J., Hwang Т.Н., Moon A., Part R., Pelusio A., Le Boeuf F., Burns J., Evgin L., De Silva N., Cvancic S., Robertson Т., Je J.E., Lee Y.S., Parato K., Diallo J.S., Fenster A., Daneshmand M., Bell J.C., Kirn D.H. Intravenous delivery of a multi-mechanistic cancer-targeted oncolytic poxvirus in humans // Nature. - 2011. - Vol. 477. - Р. 99-102]. Для преодоления этого барьера требуется введение огромных доз вируса, что удорожает метод лечения и создает дополнительные проблемы в плане безопасности. В связи с этим возникла необходимость разработки вакцины, способной минимальным количеством вирусных частиц инфицировать и лизировать опухолевые клетки. Такие вирусы должны обладать высокой репликативной активностью, тропностью к опухолевым клеткам и способностью генерировать вирулентное потомство. Патентуемый штамм NDVH-2 обладает требуемыми свойствами, что подтверждено исследованиями цитолитических свойств in vitro и анализом генома вируса.

Вирулентность штаммов определяется аминокислотной последовательностью сайта расщепления белка F. Известно, что эффективность расщепления белка F высоко вирулентных штаммов клеточными протеазами обеспечивается наличием основных аминокислот в положении 115 и 116, фенилаланина (F) в положении 117 и аргинина в положении 113. Данный фрагмент присутствует в геномной последовательности штамма NDVH-2.

За связывание вирусов с поверхностью опухолевых клеток отвечает строение белка HN. Секвенирование выявило наличие замен в аминокислотной последовательности этого белка, которые являются маркерными признаками, отличающими его от штамма-прототипа.

Родительским для заявляемого штамма является вирусвакцина против ньюкаслской болезни из штамма "Н", применяемая для вакцинации птиц. Онколитические свойства для родительского штамма не описаны.

Задачей изобретения является создание штамма вируса болезни Ньюкасла, способного избирательно инфицировать и лизировать широкий спектр неопластических клеток человека различной тканевой принадлежности.

Решение поставленной технической задачи достигается путем проведения серии адаптационных пассажей родительской вирусвакцины штамма Н на культуре клеточной линии Vero (эпителий почки африканской зеленой мартышки), с получением нового штамма NDVH-2, селективно инфицирующего и лизирующего опухолевые клетки человека in vitro для создания на его основе противоопухолевого препарата.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является обеспечение возможности создания на основе полученного штамма вируса болезни Ньюкасла онколитического вирусного препарата для терапии злокачественных новообразований человека.

Основными отличиями предлагаемого штамма NDVH-2 от вышеприведенных штаммов ВБН являются его способность к избирательному инфицированию и активному лизису широкого спектра опухолевых клеток человека малым количеством вирусных частиц.

Раскрытие изобретения

Характеристика заявляемого штамма

Штамм NDVH-2 является типичным представителем парамиксовирусов - семейство Paramyxoviridae, подсемейство Paramyxovirinae, род Avulavirus, вид Newcastle Disease Virus (Avian paramixovirus type-1). Штамм депонирован в Государственную коллекцию вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России под регистрационным номером 2780 (7 июля 2014 г).

Источник получения. Заявляемый штамм получен посредством серийного пассирования родительского штамма Н вирусвакцины ньюкаслской болезни птиц на культуре клеточной линии Vero. После пяти адаптационных пассажей на модели развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) были получены препаративные количества вирусного материала, достаточные для проведения характеризации инфекционных (литических) свойств штамма NDVH-2 на культурах опухолевых клеток человека. Индикация вируса была проведена в реакции гемагглютинации (РГА) с эритроцитами петуха: показатель гемагглютинирующей активности составил 256 ГАЕ/50 мкл.

Идентификация вируса. Первичная идентификация изолированного вируса болезни Ньюкасла осуществлялась методом ОТ-ПЦР с детекцией результатов в закрытой пробирке в режиме реального времени с использованием праймеров и зонда, специфичных к консервативным участкам М-гена вируса болезни Ньюкасла, согласно [Miller P.J., Decanini E.L., Afonso C.L. Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges // Infect Genet Evol. - 2010. - Vol. 10(1). - Р. 26-35].

NDVH-2 депонирован в международной базе GenBank под номером KU865562 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU865562.1). Нуклеотидная последовательность штамма вируса болезни Ньюкасла NDVH-2 прилагается (Приложение 1).

Культуральные свойства. Штамм NDVH-2 культивируется на монослое культуры клеток Vero. При инфицировании клеточного монослоя штамм NDVH-2 вызывает типичное для ВБН цитопатическое действие (ЦПД) через 16-48 часов в зависимости от множественности инфицирования (при температуре культивирования 37°C, в атмосфере с 5% содержанием CO₂). Культуру клеточной линии V его выращивают как монослойную на среде DMEM (Gibco BRL, Germany), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Gibco BRL, Germany) с 80 мкг/мл гентамицина сульфата. Субконфлюентный монослой клеток линии Vero инфицируют штаммом NDVH-2 с оптимальной множественностью инфицирования 0.1-0.01 MOI, после проведения адсорбции в течение 1 ч при температуре 37°C в атмосфере с 5% содержанием CO₂, инфицированный клеточный монослой инкубируют в поддерживающей среде DMEM, содержащей 2% ЭТС до наступления 75-90% ЦПД. После чего культуральную среду вместе с клетками отбирают и вируссодержащую суспензию осветляют посредством низкоскоростного центрифугирования (5000 об/мин, 10 мин).

Патогенность для человека. Штаммы вируса болезни Ньюкасла не являются патогенными для человека [Cassel W.A., Garrett R.E. Newcastle disease virus as an antineoplastic agent // Cancer. - 1965. - Vol. 18. - P. 863-868; Laurie S.A., Bell J.C., Atkins H.L., Roach J., Bamat M.K., O'Neil J.D., Roberts M.S., Groene W.S., Lorence R.M. A phase 1 clinical study of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, using two-step desensitization // Clin Cancer Res. - 2006. - Vol. 12(8). - Р. 2555-2562].

Патогенность для птицы. Штаммы вируса болезни Ньюкасла классифицируют на лентогенные (слабопатогенные), мезогенные и велогенные (высокопатогенные) (OIE, 2015). Штамм NDVH-2 относится к патогенному варианту вируса болезни Ньюкасла. Инфекционная активность выделенного вируса составила 7,4±0,07lg ЭЛД₅₀/мл.

Патогенность штамма устанавливали согласно стандартным методикам в тестах на определение среднего времени жизни (MDT) развивающихся куриных эмбрионов и интрацеребрального индекса патогенности суточных цыплят (ICPI) [OIE, World Organisation for Animal Health, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Paris, France, 7th edition. 2012. Vol. 1-2. Ch.2.03.14. http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.03.14_NEWCASTLE_DIS.pdf.].

Среднее время жизни MDT=48 часов при разведении вируса 10^-7, что соответствует значению для высокопатогенных (велогенных) штаммов ВБН. Показатель индекса интрацеребральной патогенности для цыплят составляет ICPI=1,25, что соответствует мезогенному патотипу.

Патогенность для млекопитающих. Штамм не проявляет патогенности для млекопитающих [Alexander D.J. Newcastle disease virus and other avian paramyxoviruses // Rev. Sci. Tech. - 2000. - Vol. 19(2). - Р. 443-462].

Для длительного хранения штамм необходимо лиофилизировать с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение не менее 2 лет при хранении на -70°C.

Для культивирования штамма в культуре клеток используют следующие питательные среды: MEM, DMEM, содержащие 1% ЭТС, 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина.

Примеры использования штамма вируса болезни Ньюкасла NDVH-2 для изучения возможности разработки на его основе вирусного онколитического препарата для терапии злокачественных новообразований человека

При исследовании инфекционных (цитолитических) свойств штамма NDVH-2 на панели опухолевых и нормальных клеток человека (см. Пример 1) показано, что он обладает высокой степенью избирательной литической активности in vitro в отношении использованных опухолевых культур клеток. При инфицировании штаммом NDVH-2 нормальных диплоидных фибробластов человека жизнеспособность клеточной культуры снижается на 20%, тогда как в отношении опухолевых клеток этот показатель составляет от 70 до 40%. Следует отметить, что для достижения указанного цитолитического эффекта достаточно 10 вирусных частиц на одну клетку, что демонстрирует высокую вирулентность и репликативные характеристики штамма.

Наибольший цитолитический эффект отмечен для клеток линий: U87 (глиобластома) - 29% жизнеспособных клеток на 3 сутки после инфицирования, H1299 (рак лекого), - 35% и для клеток аденокарциномы молочной железы SkBr-3 и MCF7 - 50% и 67% соответственно, что значительно ниже этого показателя для нормальных диплоидных клеток человека.

Полная нуклеотидная последовательность генома штамма NDVH-2 депонирована в международной базе GenBank под номером KU865562 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU865562.1). При проведении анализа полной нуклеотидной последовательности генома штамма NDVH-2 в сравнении с опубликованными последовательностями различных штаммов вируса болезни Ньюкасла показано, что наиболее близким по нуклеотидной последовательности штаммами к представляемому штамму (99% гомологии) является штамм Mukteswar (Newcastle disease virus strain Mukteswar, GenBank JF950509.1, EF201805.1) - 48 нуклеотидных отличий, и штаммы JS/9/05/Go (GenBank FJ430160.1) и JS/7/05/Ch (GenBank FJ430159.1) - 51 и 55 нуклеотидных отличий, соответственно. В то же время, с другими штаммами ВБН процент гомологии по нуклеотидной последовательностям составляет 92% и ниже.

Сравнение представленных в базе данных GenBank нуклеотидной последовательности кодирующих белки F (Y16170.1) и HN (Y17149.1) родительского штамма и штамма NDVH-2, выявили 3 нуклеотидных замены для гена F и 15 - для гена HN (см. Таблица 1). Некоторые из этих замен приводят к замене аминокислоты. Так для белка F глутаминовая кислота Glu в 15 позиции в родительском штамме заменена на аспарагиновую кислоту Asp в штамме NDVH-2. Для белка HN обнаружено 3 аминокислотных замены: Val₂₄→Gly, Ser₃₆₈→Arg и Ile₄₅₃→Val. Данные аминокислотные замены являются маркерными признаками для штамма NDVH-2, отличающими его от штамма-прототипа.

Пример 1.Исследование литической активности штамма NDVH-2 на панели нормальных (нетуморогенных) диплоидных и опухолевых культур клеток человека.

Инфекционную (литическую) активность штамма NDVH-2 определяли in vitro на культурах опухолевых клеток человека различной тканевой принадлежности: линия H1299 (немелкоклеточный рак легкого), U87 (глиобластома), SkBr-3 и MCF7 (аденокарцинома молочной железы) и HFF10 (нормальные фибробласты крайней плоти человека). Клетки высаживали на 96-луночный планшет за день до инфицирования в количестве 20000 на лунку. Заражение проводилось суспензией вируса в 25 мкл фосфатного буфера с последующей инкубацией 1 час при температуре 37°C и в атмосфере с 5% содержанием CO₂. Количество вирусных частиц составляло 10 вирусных частиц на 1 клетку. Определение физического титра проводилось согласно [Malenovska Н. Virus quantitation by transmission electron microscopy, TCID50, and the role of timing virus harvesting: A case study of three animal viruses // J Virol Methods. - 2013. - Vol. 191(2). - P. 136-140] и определялось исходя из соотношения вирусных частиц к латексным зернам известной концентрации. Подсчет вирусных частиц и латексных зерен проводился с использованием электронного микроскопа Libra210 (CarlZeiss).

Литическую активность исследуемых штаммов для соответствующих типов клеток определяли методом колометрического анализа с использованием реактива CellTiter 96®AQueous OneSolutionCellProliferationAssay (Promega, USA) согласно прилагаемой инструкции фирмы-производителя. Жизнеспособность клеток всех опухолевых линий человека и нормальных диплоидных фибробластах человека на третьи сутки после инфицирования штаммом NDVH-2 оценивали по относительным значениям доли живых клеток к контрольным не обработанным вирусом клеткам. Результаты исследования представлены в Фиг. 1 в виде гистограммы как средние относительные значения доли живых клеток на третьи сутки после обработки штаммами вируса к доли контрольных не обработанных вирусом клеток с учетом стандартного отклонения (среднее относительное значение ± стандартное отклонение).

На Фиг. 1: Цитолитическое воздействие штамма NDVH-2 на линии опухолевых клеток человека и нормальные диплоидные фибробласты человека in vitro на третьи сутки после инфицирования. H1299 (немелкоклеточный рак легкого), U87 (глиобластома), SkBr-3 и MCF7 (аденокарцинома молочной железы), HFF10 (нормальные фибробласты крайней плоти человека).

Показано, что штамм NDVH-2 оказывает низкое цитолитическое воздействие на нормальные диплоидные клетки человека (жизнеспособность клеток составляет 80%±5) и эффективно лизирует опухолевые культуры Н1299 (32%±7), U87 (29±10), SkBr-3 (50%±9), MCF7 (67%±7). Таким образом, штамм NDVH-2 обладает выраженной способностью к селективному инфицированию и лизису опухолевых клеток в культуре различной тканевой принадлежности.

Пример 2. Определение и сравнительный анализ полной нуклеотидной последовательности генома штамма NDVH-2.

Для проведения полногеномногосеквенирования из суспензии вируса выделялась РНК, которую использовали для приготовления ДНК-библиотеки с помощью набора TruSeq RNA Library. Качество библиотеки оценивали на Bioanalyzer. Библиотека секвенировалась на платформе MiSeq с набором 2×300, а полученные парные риды использовались для de novo сборки генома (CLC GW). В геноме были найдены открытые рамки считывания и проведена аннотация генов. Полная нуклеотидная последовательность генома штамма NDVH-2 депонирована в международной базе GenBank под номером KU865562 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU865562.1). Анализ полных нуклеотидных последовательностей показал, что штамм NDVH-2 относятся к классу 2 генотипу 3. По сравнению с родительским штаммом штамм NDVH-2 имеет в белках F и NH 18 нуклеотидных замен, четыре из которых приводят к аминокислотным заменам (см. Таблица 1). Так для белка F глутаминовая кислота Glu в 15 позиции в родительском штамме заменена на аспарагиновую кислоту Asp в штамме NDVH-2. Для белка HN обнаружено 3 аминокислотных замены: Val₂₄→Gly, Ser₃₆₈→Arg и Ile₄₅₃→Val. Данные аминокислотные замены являются маркерными признаками для штамма NDVH-2, отличающими его от штамма-прототипа.

Список использованных источников

1. Юрченко К.С., Губанова Н.В., Шестопалова Л.В., Щелканов М.Ю., Шестопалов A.M. 2015. Онколитические свойства вируса болезни Ньюкасла // Тихоокеанский Медицинский Журнал - 2015. - №3. - С. 14-19.

2. Alexander D.J. Newcastle disease virus and other avian paramyxoviruses // Rev Sci Tech. - 2000. - Vol. 19(2). - P. 443-462.

3. Breitbach C.J., Burke J., Jonker D., Stephenson J., Haas A.R., Chow L.Q.M., Nieva J., Hwang Т.Н., Moon A., Patt R., Pelusio A., Le Boeuf F., Burns J., Evgin L., De Silva N., Cvancic S., Robertson Т., Je J.E., Lee Y.S., Parato K., Diallo J.S., Fenster A., Daneshmand M., Bell J.C., Kirn D.H. Intravenous delivery of a multi-mechanistic cancer-targeted oncolytic poxvirus in humans // Nature. - 2011. - Vol. 477. - P. 99-102.

4. Cassel W.A., Garrett R.E. Newcastle disease virus as an antineoplastic agent // Cancer. - 1965. - Vol. 18. - P. 863-868.

5. Gubanova N.V., Gaytan A.S., Razumov I.A., Mordvinov V.A., Krivoshapkin A.L., Netesov S.V., Chumakov P.M. 2012. Oncolytic viruses in the therapy of gliomas // MolBiol+. - 2012. - Vol. 46. - P. 780-789.

6. Laurie S.A., Bell J.C., Atkins H.L., Roach J., Bamat M.K., O'Neil J.D., Roberts M.S., Groene W.S., Lorence R.M. A phase 1 clinical study of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, using two-step desensitization // Clin Cancer Res - 2006. - Vol. 12(8). - P. 2555-2562.

7. Malenovska H. Virus quantitation by transmission electron microscopy, TCID50, and the role of timing virus harvesting: A case study of three animal viruses // J Virol Methods. - 2013. - Vol. 191(2). - P. 136-140.

8. Miller P.J., Decanini E.L., Afonso C.L. Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges // Infect Genet Evol. - 2010. - Vol. 10(1). - P. 26-35.

9. OIE, World Organisation for Animal Health, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Paris, France, 7th edition. 2012. Vol. 1-2. Ch.2.03.14. http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.03.14_NEWCASTLE_DIS.pdf.

10. World Health Organization (WHO). World Health Statistics 2012. Geneva: WHO. Euro Surveill. - 2012. Vol. 17(20). Available from: http://www.who.int/gho/publications/world_health_statistics/EN_WHS2012_Full.pdf.