МСН-СПЕЦИФИЧНЫЕ ПЕПТИДЫ СО СМЕЩЕННОЙ РАМКОЙ СЧИТЫВАНИЯ (ПСРС) ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ РАКА

Изобретение обеспечивает вакцину для предотвращения и лечения рака, характеризующегося микросателлитной нестабильностью (МН). Вакцина содержит МСН-специфичный пептид со смещенной рамкой считывания (ПСРС), обеспечивающий гуморальный и клеточный иммунные ответы против опухолевых клеток или нуклеиновых кислот, кодирующих ПСРС.

Опухоли человека развиваются через два главных пути генетической нестабильности: хромосомная нестабильность и микросателлитная нестабильность (МСН), которая возникает в результате дефектов в системе репарации ошибочно спаренных оснований в ДНК. МСН встречается в 15% случаев колоректального рака и в ряде других внекишечных злокачественных новообразований с недостаточной активностью системы репарации ошибочно спаренных оснований в ДНК, таких как рак эндометрия, рак желудка, рак тонкой кишки и опухоли других органов. Раковые заболевания, связанные с МСН, могут развиваться спорадически или в контексте наследственного опухолевого синдрома, наследуемого неполипозного колоректального рака и синдрома Линча.

Колоректальные раковые заболевания с МСН характеризуются высокой иммуногенностью, которая является результатом образования многочисленных пептидов со смещенной рамкой считывания (ПСРС) в ходе развития опухолей с МСН, образующихся как результат недостаточной активности системы репарации ошибочно спаренных оснований в ДНК, приводящей к изменениям в рамке считывания при трансляции, в случае мутаций микросателлитов в кодирующих гены участках (Фиг. 1).

Многочисленность предсказуемых специфичных МСН-специфичных антигенов - ПСРС и тот факт, что их образование напрямую связано с процессом злокачественной трансформации, делает ПРСР весьма перспективными мишенями для иммунной терапии. Считается, что человеческая иммунная система является потенциальным ресурсом для уничтожения опухолевых клеток и что может быть разработан эффективный способ лечения, если компоненты иммунной системы должным образом стимулировать для распознавания и уничтожения раковых клеток. Таким образом, иммунотерапия, которая включает составы и способы для активации иммунной системы организма, напрямую или опосредованно направленной на подавление или уничтожение рака, на протяжении многих лет исследуется как дополнение к обычной терапии раковых заболеваний.

Общепризнано, что рост и метастазирование опухолей в большой степени зависят от их способности избегать надзора иммунной системы больного. Большинство опухолей экспрессируют антигены, которые с разной степенью успешности распознаются иммунной системой больного, но во многих случаях ответ иммунной системы недостаточен. Неспособность вызвать сильную активацию эффекторных Т-клеток может быть результатом слабой иммуногенности антигенов опухолевых клеток или недостаточной или отсутствующей экспрессией костимуляторных молекул опухолевыми клетками. Для большинства Т-клеток продукция интерлейкина 2 и пролиферация требуют костимуляторного сигнала одновременно с активацией рецепторов Т-клеток, иначе Т-клетки могут войти в функционально нечувствительное состояние, известное как клональная анергия.

Несмотря на продолжительность исследования этих видов терапии, остается потребность в улучшенных стратегиях усиления иммунного ответа против опухолевых антигенов.

Тем не менее, в данной области существует потребность в безопасных и эффективных составах, которые могли бы стимулировать иммунную систему, в качестве иммунотерапии раковых заболеваний.

Согласно представленному изобретению безопасная и эффективная стимуляция иммунной системы в качестве иммунотерапии рака достигается благодаря объектам, определенным в формуле изобретения. Полученные in vitro данные показали, что ПСРС высокоиммуногенны и могут вызывать выраженный ПСРС-специфичный Т-клеточный ответ (innebacher et al., 2001, Ripberger et al., 2003, Schwitalle et al., 2004). В дальнейших исследованиях по изучению переферической крови, взятой у пациентов со связанным с МСН раком кишки, была показана высокая частота ПСРС-специфичных Т-клеточных ответов (Schwitalle et al. 2008). Несмотря на большое количество ПСРС-специфичных Т-клеток в опухоли и периферической крови, пациенты не имели признаков аутоиммунной реакции, что позволяет предположить, что подходы с вакцинацией ПСРС не будут иметь побочных эффектов, связанных с аутоиммунной реакцией.

Иммунологический анализ индивидов, несущих мутацию в генах системы репарации ошибочно спаренных оснований в ДНК в зародышевой линии, обуславливающую предрасположенность к наследуемому неполипозному колоректальному раку, также показал клеточный иммунный ответ против ПСРС даже в отсутствие клинически обнаружимой опухоли.

Это позволяет предположить, что ПСРС-специфичный иммунный ответ может играть защитную роль у индивидов с наследуемым неполипозным колоректальным раком, что дает возможность предположить, что ПСРС-вакцинация также может быть использована в качестве превентивной меры как первичный превентивный подход для пациентов с наследственной предрасположенностью к раку.

Таким образом:

A. Пептиды со смещенной рамкой считывания (ПСРС) специфичны для микросателлитной нестабильности и являются прямым результатом патогенеза связанных с МСН опухолей.

Б. Не ожидается клинически значимых побочных эффектов.

B. Ожидается, что комбинации ПСРС будут направлены на все опухоли с МСН.

Г. Была разработана ПСРС-вакцинация для терапии 15% раковых заболеваний кишки, опухолей эндометрия, желудка, тонкой кишки и других органов.

Д. Молекулярный анализ опухоли может определить пациентов, для которых ПСРС-вакцинация может быть полезна (таргетная терапия).

Е. ПСРС-вакцинация может использоваться в качестве превентивной вакцинации для групп высокого риска.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1: Схематическая иллюстрация кодирующей микросателлитной нестабильности, вызванной недостаточностью системы репарации ошибочно спаренных оснований в ДНК (Kloor et al., 2010).

Укороченные белки, охватывающие последовательности ПСРС, образуются, когда мутации кодирующих микросателлитных участков приводят к сдвигу рамки считывания (пример: белок TGFBR2).

Фиг. 2: Примеры Т-клеточных ответов против новых ПСРС в периферической крови от трех пациентов со связанным с МСН раком кишки.

Фиг. 3: Гуморальный иммунный ответ на ПСРС, полученные из АIМ2(-1), HT001(-1), TAF1B(-1) и TGFBR2(-1). Твердофазный иммуноферментный анализ показал, что ПСРС-специфичный ответ антител, направленный против неопептидов, полученных из - AIM2(-1), HT001(-1), TAF1B(-1) и TGFBR2(-1). Специфичность пептидов была продемонстрирована преципитацией соответствующих антител в сыворотке, как было описано ранее (Reuschenbach et al., 2008).

Фиг. 4: Цитотоксические ответы, определенные по экспрессии поверхностного CD107а

А. Значительные ПСРС-специфичные ответы наблюдались у различных здоровых доноров после стимуляции Т-клеток антигеном на протяжении 4 недель. Иммунный ответ возникал только в присутствии антигенпрезентирующих В-клеток и ПСРС-антигена. Репрезентативные реакции показаны на гистограммах.

Б. Репрезентативный анализ методом FACS CD107а для Т-клеток, инкубированных с В-клетками, служащими в качестве антигенпрезентирующих клеток в отсутствие (левая панель) и в присутствии (правая панель) ПСРС-антигена НТ001(-1).

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает вакцину, содержащую пептиды со смещенной рамкой считывания (ПСРС), специфические для микросателлитной нестабильности, например, полученные из TAF1B (№ доступа L39061), НТ001 (№ доступа AF113539), AIM2 (Acc.No, AF024714) или TGFBR2 (№ доступа NM 003242) или нуклеиновую кислоту, кодирующую названные ПСРС, причем указанные ПСРС способны вызывать иммунный ответ против связанного с МСН рака.

В предпочтительном варианте реализации вакцина согласно настоящему изобретению содержит:

(a) ПСРС, содержащий следующую последовательность аминокислот или состоящий из нее:

или

(b) функциональный эквивалент ПСРС согласно (b) или

(c) комбинацию ПСРС согласно (а) и/или (b).

Термин «функциональный эквивалент» в настоящем тексте относится например, к вариантам или фрагментам ПСРС, которые сохраняют способность вызывать иммунный ответ, направленный против рака, то есть, могут быть использованы в качестве эффективной вакцины. Иммунный ответ определяется как состояние, отвечающее по меньшей мере одному из следующих критериев: 1. Индукция СD8-положительных Т-клеток, обнаруживаемых с помощью анализов цитотоксичности или по секреции интерферона гамма, экспрессии перфоринов, экспрессии гранизима В, или других цитокинов, которые могут продуцироваться СD8-положительными Т-клетками, которая может быть измерена как значение выше фонового методом иммуноферментных пятен (ELISpot), или внутриклеточного окрашивания на цитокины, или с использованием ИФА (ELISA) на цитокины, или эквивалентными методами. 2. Индукция СD4-положительных Т-клеток, обнаружимая по секреции цитокинов, которая может быть измерена как значение выше фонового методом иммуноферментных пятен (ELISpot), или методом внутриклеточного окрашивания на цитокины, или с использованием ИФА (ELISA) на цитокины, или эквивалентными методами. Цитокины могут включать интерферон альфа, интерферон гамма, интерлейкин-2, интерлейкин-5, интерлейкин-6, интерлейкин-10, интерлейкин-12, интерлейкин-13, интерлейкин-17, фактор некроза опухоли альфа, фактор некроза опухоли бета или другие цитокины, которые продуцируются CD4-положительными Т-клетками. 3. Индукция антител, обнаружимая методом вестерн-блоттинга, ИФА или эквивалентными или связанными с ними методами. 4. Индукция клеточного иммунного ответа любого типа, не опосредованного CD8-положительными Т-клетками и СD4-положительными Т-клетками, описанными в пп. 1 и 2.

Варианты характеризируются делециями, заменами и/или вставками аминокислот. В предпочтительном варианте аминокислотные различия связаны с одной или более консервативными заменами аминокислот. Термин «консервативные замены аминокислот» включает замены алифатических или гидрофобных аминокислот Ala, Val, Leu, Ilе; замену гидроксильных остатков Ser и Thr; замену кислотных остатков Asp и Glu; замену амидных остатков Asn и Gln; замену основных остатков Lys, Arg и His; замену ароматических остатков Phe, Tyr и Тrр; замену некрупных аминокислот Ala, Ser, Thr, Met и Gly.

Для создания пептидов, обладающих определенной степенью идентичности с ПСРС, может использоваться, например, генетическая инженерия для введения изменений аминокислот в определенных положенииях клонированной последовательности ДНК для определения участков, критически важных для функционирования пептида. Например, могут быть использованы сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (введение единичных аланиновых мутаций при каждом остатке в молекуле) (Cunningham and Wells, 1989). Полученные мутантные молекулы можно исследовать с использованием анализа, показанного в Примере 1.

Предпочтительные варианты характеризируются не более чем 8 аминокислотными, желательно не более чем 6 аминокислотными, и, еще более предпочтительно, не более чем 4 аминокислотными заменами, делециями и/или вставками.

Во фрагменте ПСРС по меньшей мере 5 последовательных аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 10 последовательных аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере 15 последовательных аминокислот и еще более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательных аминокислот определенной аминокислотной последовательности остаются неизменными. Фрагмент сохраняет способность вызвать иммунный ответ.

В более предпочтительном варианте реализации вакцина согласно настоящему изобретению дополнительно содержит адъювант и/или иммуностимулирующий цитокин или хемокин.

Подходящими адъювантами являются соли алюминия, такие как гель из гидроксида алюминия или фосфат алюминия, но могут также использоваться соли кальция, железа или цинка, или может использоваться нерастворимая суспензия ацилированного тирозина или ацилированных сахаров, анионные или катионные производные полисахаридов или полифосфазенов. Другие адъюванты включают CpG-содержащие олигонуклеотиды. Олигонуклеотиды характеризуются наличием неметилированных динуклеотидов CpG. Подобные олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в WO 96/02555.

Применение иммуностимулирующих цитокинов открывает все новые перспективы в иммунотерапии рака. Главной задачей является активация опухольспецифичных Т-лимфоцитов, способных удалять опухолевые клетки у пациентов с низкой опухолевой нагрузкой или защищать пациента от рецидивов заболевания. Стратегии, которые обеспечивают высокие уровни иммуностимулирующих цитокинов локально в месте нахождения антигена, продемонстрировали эффективность в доклинических и клинических тестах. Предпочтительные иммуностимулирующие цитокины включают интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин-7, интерлейкин-12, интерлейкин-13, имунноглобулины, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и фактор некроза опухоли альфа.

Хемокины представляют собой небольшие (7-16 кДа) секретируемые структурно близкие растворимые белки, которые вовлечены хемотаксис лейкоцитов и дендритных клеток, дегрануляцию полиморфноядерных лейкоцитов и ангиогенез. Хемокины продуцируются в ходе начальной фазы реакции организма на повреждения, аллергены, антигены и вторгающиеся микроорганизмы. Хемокины избирательно привлекают лейкоциты в место воспаления, индуцируя активацию и миграцию клеток. Хемокины могут усиливать собственный иммунитет против опухолей и, таким образом, также могут быть полезны в комбинации с ПСРС.

Вакцина согласно настоящему изобретению может также содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую ПСРС, для ДНК-иммунизации, как методика, используемая для стимуляции гуморальной и клеточной иммунной реакции на белковые антигены. Прямое введение генетического материала в живой организм приводит к тому, что небольшое количество его клеток продуцируют продукты введенного гена. Эта анормальная экспрессия гена имеет важные иммунологические последствия, приводя к специфической иммунной активации организма против антигена, привнесенного геном. Прямое введение ни с чем не связанной плазмидной ДНК вызывает сильный иммунный ответ на антиген, кодируемый геном вакцины. Как только плазмидный конструкт вводится в клетки организма, они начинают экспрессировать ген вируса и производить ПСРС внутри клетки. Эта форма презентации и процессинга антигена индуцирует активацию как рецепторов главного комплекса гистосовместимости I, так и рецепторов главного комплекса гистосовместимости II, вызывая клеточный и гуморальный иммунный ответ. ДНК-вакцины состоят из векторов, в норме содержащих два блока: антиген-экспрессирующий блок состоит из промотерных/энхансерных последовательностей, за которыми следует участок, кодирующий ПСРС-антиген, и полиадениловую последовательность; блок продукции состоит из последовательностей, необходимых для отбора и амплификации вектора. Конструирование векторов со вставками вакцины осуществляется при помощи технологии рекомбинантной ДНК, и специалистам в данной области известны векторы, которые могут использоваться в данном подходе. Эффективность ДНК-иммунизации может быть повышена путем стабилизации ДНК против деградации и повышения эффективности доставки ДНК в антигенпрезентирующие клетки. Это было продемонстрировано путем покрытия биодеградируемых катионных микрочастиц (таких как состоящие из полилактид-гликолида, связанного с цетилтриметиламмоний-бромида) молекулами ДНК. Такие покрытые ДНК микрочастицы могут быть также эффективны в увеличении числа цитотоксичных Т-лимфоцитов в крови, как и рекомбинантные вирусы вакциния, особенно, в смеси с квасцами. Оказалось, что частицы диаметром 300 нм наиболее эффективно поглощаются антигенпрезентирующими клетками.

Различные экспрессионные векторы, например, плазмиды или вирусные векторы, могут быть использованы для переноса и экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих ПСРС согласно настоящему изобретению.

Предпочтительными вирусными векторами являются поксивирус, аденовирус, ретровирус, герпевирус или аденоассоциированный вирус. Особенно предпочтительными среди поксивирусов являются вирус вакциния, NYVAC, авипоксвирус, канарипокс вирус, ALVAC, ALVAC(2), оспа птиц и TROVAC.

Рекомбинантные векторы на основе альфавируса также используются для улучшения эффективности ДНК-вакцинации. Ген, кодирующий ПСРС, был введен в репликон альфавируса вместо структурных генов, при этом неструктурные гены репликаз остаются интактными. Для построения рекомбинантного репликона альфавируса используются вирус Синдбис и вирус леса Семлики. Однако, в отличие от обычных ДНК-вакцин, экспрессия векторов на основе алифавирусов является временной. Альфавирусные репликоны вызывают иммунный ответ благодаря высокому уровню экспрессии белка, кодируемого данным вектором, репликон-индуцированным цитокинным ответам или репликон-индуцированному апоптозу, ведущим к усиленному поглощению антигена дендритными клетками.

Согласно следующему конкретному варианту реализации ПСРС содержит маркерную последовательность, предпочтительно на С-конце, которая использована для очистки полученного рекомбинантным путем ПСРС. Предпочтительной маркерной последовательностью является His-маркер. Особенно предпочтительно использование His-маркера, содержащего 6 остатков His.

Вакцину, представленную в настоящем изобретении, вводят в количестве, подходящем для иммунизации индивида и, в предпочтительном варианте, она дополнительно содержит один или более обычных вспомогательных веществ. Используемый термин «количество, подходящее для иммунизации индивида» включает в себя любое количество ПСРС, которым может быть иммунизирован индивид. Количество вакцины зависит от того, предназначается ли иммунизация для профилактического или терапевтического лечения. В дополнение, возраст, пол и вес индивида влияют на количество вводимой вакцины. Таким образом, количество, подходящее для иммунизации индивида, относится к количествам активных ингредиентов, достаточным для воздействия на прогрессирование и тяжесть опухоли, обеспечивающего уменьшение или ремиссию такой патологии. «Количество, подходящее для иммунизации индивида» может быть определено путем использования методов, известных профессионалу в данной области (например, Fingl et al., 1975). Термин «индивид» в настоящем тексте включает индивидов любого вида, которые могут заболевать карциномами. Примерами индивидов служат люди и животные, равно как и их клетки.

Введение вакцины путем инъекции может осуществляться в разные участки тела индивида внутримышечно, подкожно, внутрикожно или в любой другой форме применения. Также может быть предпочтительным введение одной или более «поддерживающих инъекций», имеющих примерно равные объемы.

Используемый термин «обычные вспомогательные вещества» включает вспомогательные вещества, подходящие для вакцинации для иммунизации индивида. Подобными вспомогательными веществами являются, например, буферные солевые растворы, вода, эмульсии, такие как водно-масляная эмульсия, смачивающие вещества, стерильные растворы и т.д.

ПСРС, последовательность нуклеиновых кислот или вектор согласно настоящему изобретению могут присутствовать в вакцине отдельно или в комбинации с носителями. В предпочтительном варианте носители неиммуногенны в организме данного индивида. Подобными носителями могут быть собственные белки индивида, чужеродные белки или их фрагменты. Предпочтительны такие носители, как альбумин сыворотки крови, фибриноген и трансферин или их фрагменты.

Вакцина согласно настоящему изобретению может быть терапевтической, т.е. относится к веществам, которые вводят для лечения существующего ракового заболевания, или применяться для предотвращения рецидива рака, или профилактической, т.е. относиться к веществам, которые для предотвращения или задержки развития ракового заболевания. Если композиции имеют терапевтическое назначение, их вводят пациентам с раковыми заболеваниями и они предназначены для стимуляции иммунного ответа для стабилизации опухоли путем предотвращения или замедления роста существующей опухоли, для предотвращения распространения опухоли или ее метастазов, для уменьшения размеров опухоли, для предотвращения рецидива опухоли, которую лечат, или для устранения раковых клеток, которые не были уничтожены в процессе предшествующего лечения. Вакцина может использоваться в качестве профилактического лечения и вводиться индивидам, у которых нет ракового заболевания, в этом случае она предназначена для того, чтобы вызвать иммунный ответ против потенциальных раковых клеток.

Настоящее изобретение также относится к применению ПСРС и их функциональных эквивалентов, последовательностей нуклеиновых кислот или векторов, как определено выше, для изготовления вакцины для предотвращения карциномы, например, превентивной вакцинации групп высокого риска, или лечения карциномы. Например, это может быть колоректальный рак, предпочтительно наследственный неполипозный колоректальный рак, рак эндометрия, рак желудка или рак тонкой кишки.

Настоящее изобретение обеспечивает возможность иммунизировать индивидов, в частности, людей и животных. Иммунизация происходит как благодаря индукции образования антител, так и стимуляции CD8⁺ Т-клеток. Таким образом, возможно принимать профилактические и терапевтические меры против карцином.

Нижеследующие примеры описывают изобретение более подробно:

Пример 1

Детектирование ПСРС-специфичных Т-клеток в периферической крови пациентов со связанным с МСН раком толстой кишки и у здоровых носителей мутации наследуемого неполипозного колоректального рака

(А) Методы: Метод иммуноферментных пятен (ELISpot).

Частоту обнаружения ПСРС-специфических периферических Т-клеток (ПТК) оценивали путем определения количества специфических Т-клеток, секретирующих интерферон гамма, направленных против новых ПСРС, полученных из трех содержащих солирующие микросателлиты кандидатных генов, используя анализ ELISpot. Анализ ELISpot проводили в 96-луночных нитроцеллюлозных планшетах (Multiscreen; Millipore, Бэдфорд, Массачусетс, США), покрытых мышиными моноклональными антителами, против человеческого интерферона-гамма (Mabtech, Нака, Швеция) в течение ночи и блокированных средой, содержащей сыворотку. ПТК (День 0, концентрация 1×10⁵ на лунку) были высеяны шестикратно с аутологичными СD40-активированными В-лимфоцитами (4×10⁴ на лунку, Т-независимые и плазматические В-клетки соответственно) в качестве антигенпрезентирующих клеток в 200 микролитрах среды IMDM с добавлением 10% сыворотки человека АВ. В качестве положительного контроля ПТК обрабатывали форбол-12-миристат-13 ацетатом в концентрации 20 нмоль/л в комбинации с 350 нмоль/л иономицина. После 24-часовой инкубации при температуре в 37°С планшеты тщательно промывали и инкубировали с биотинилированными моноклональными антителами кролика против интерферона-гамма в течение 4 часов, затем снова промывали, инкубировали с конъюгатом стрептавидин-щелочная фосфатаза в течение 2 часов с последующей конечной промывкой. Пятна обнаруживались после инкубации с NBT/BCIP (Sigma-Aldrich) в течение 1 часа, реакция останавливалась водой, и после просушки подсчет пятен проводился путем микроскопирования. Методика подробно описана в статье Schwitalle et al., 2008.

(Б) Результаты

Для проверки, будет ли ПСРС-специфическая реакция Т-клеток обнаруживаться в периферической крови пациентов со связанным с МСН колоректальным раком, провели анализ ELISpot. Аутологичные плазматические В-клетки, которые показали высокий уровень экспрессии белков главного комплекса гистосовместимости I и II класса и костимуляторов (CD40, CD80 и CD86), так же как и специфических В-клеточных антигенов (CD19 и CD23), использовали в качестве антигенпрезентирующих клеток.

Наблюдали выраженную реактивность по отношению к новым ПСРС, полученным из AIM-2(-1), НТ001(-1), TAF1B(-1) и TGFBR2(-1):

(подчеркнуты неопептидные последовательности)

В таблице 1 показаны результаты, полученные от пациентов (n=8). Репрезентативные результаты ELISpot показаны на фигуре 2.

Приведено среднее количество пятен из анализа в репликате для каждого пептида и исследуемого индивида. MSI01-MS07 - пациенты с МН колоректальным раком, МС01-МС06 - здоровые пациенты носители мутации наследуемого неполипозного колоректального рака.

Пример 2

Детектирование ПСРС-специфического гуморального иммунного ответа в периферической крови пациентов со связанным с МСН колоректальным раком и здоровых носителей мутации наследуемого неполипозного колоректального рака

(А) Методы (Твердофазный ИФА (ELISA))

Для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) пептидами покрывали лунки 96-луночных полистирольных микротитровальных планшетов «Максисорп» (Nunc, Роскильде, Дания) в конечной концентрации 40 мкг/мл в фосфатно-буферном растворе (PBS) и выдержаны в течение ночи при температуре 4°С. После этого ячейки были промыты 4 раза с помощью ФБР (с добавлением 0,05% Tween) и блокированы в течение 1 часа 0,5% казеином в ФБР. Связывание пептидов с микротитровальными планшетами и оптимальную концентрацию насыщения для пептидов оценивали, используя конкурентный анализ пептид-щелочная фосфатаза. Для слежения за индивидуальной фоновой реактивностью каждой сыворотки добавляли контрольный пептид, полученный из белка p16^INK4a (р16 76-105), реактивность антител к которому была выявлена у большой когорты индивидов (Rueshenbach et al., 2008). Каждую сыворотку разбавляли в отношении 1:100 в блокирующем буфере (0,5% казеина в ФБР) и исследовали в дупликатах на присутствие антител ко всем ПСРС и контрольному пептиду. В качестве эталона для определения межпланшетной вариации в каждый планшет включали одну контрольную сыворотку, и пептид-специфические оптические плотности контрольной сыворотки использовали для нормировки. Разведенную сыворотку (50 мкл/лунка) инкубировали в течение 1 часа, после этого промывали, планшеты инкубировали с меченными пероксидазой хрена антителами кролика, специфичными к человеческому иммуноглобулину G (Jackson Immunoreserach, Уэст Гроув, Пенсильвания; 1:10000 в блокирующем буфере) в течение 1 часа. После последующей промывки в каждую лунку добавляли по 50 мкл реагента ТМВ (Sigma, Дейзенхофен, Германия), через 30 минут фурментативную реакцию останавливали добавлением в каждую ячейку по 50 мкл 1Н H₂SO₄. Поглощение измеряли при воздействии излучения с длиной волны в 450 нм (референсная длина волны 595 нм). Предварительную адсорбцию антител сыворотки для контроля специфичности осуществляли в соответствии с методом, подробно описанным у Reuschenbach et al., 2008.

(Б) Результаты

Для оценки возможности детектирования ПСРС-специфических антител в периферической крови пациентов со связанным с МСН колоректальным раком, здоровых носителей синдрома Линча и здоровых контрольных пациентов, использовали твердофазный ИФА-анализ. Наблюдалась выраженная реактивность по отношению к новым ПСРС, полученным из AIM2(-1), НТ001(-1), TAF1B(-1) и TGFBR2(-1). Результаты ИФА показаны на фигуре 3.

Пример 3

Определение ПСРС-специфической Т-клеточного цитотоксического ответа

Измеряли поверхностную экспрессию CD107а на эффекторных Т-клетках после стимуляции клиническими ПСРС-антигенами. Тесты на CD107а использовали для демонстрации секреции цитотоксических гранул, содержащих ферменты перфорин и гранзим В, из эффекторных клеток. Молекулы CD107а экспрессируются на поверхности цитотоксических гранул и могут детектироваться на поверхности клетки, когда гранула высвобождается в условиях Т-клеточного цитотоксического ответа.

Для определения способности ПСРС-пептидов вызывать цитотоксическую реакцию, брали кровь здоровых доноров, и Т-клетки стимулировали пептидом ПСРС, используя дендритные клетки и антигенпрезентирующие клетки. Стимуляцию проводили еженедельно в течение четырех недель. По истечении четырех недель Т-клетки собирали и инкубировали и впоследствии проводилась проба, и тест на ПСРС с CD107а использовали для анализа пептид-специфической индукции цитотоксического ответа Т-клеток.

Цитотоксические ответы, определяемые по поверхностной экспрессии CD107а, наблюдали у Т-клеток, инкубированных с В-клетками, служащими в качестве антигенпрезентирующих клеток, в присутствии антигенных ПСРС (Фиг. 4А). Значительные ответы наблюдали у различных здоровых доноров после стимуляции Т-клеток антигеном в течение четырех недель. Репрезентативные реакции показаны на гистограммах. На фиг. 4Б показан репрезентативный результат проточной цитофлуориметрии в тесте на CD107а для Т-клеток, инкубированных с В-клетками, служащими в качестве антигенпрезентирующих клеток, в отсутствие (левая панель) и в присутствии (правая панель) ПСРС-антигена НТ001(-1).

Источники информации

Cunningham and Wells, Science 244 (1989), 1081-1085.

Fingl et al., The Pharmocological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds. acmillan Publishing Co., New York, pp.1-46 (1975).

Kloor M, Michel S, von Knebel Doeberitz M. Immune evasion of microsatellite unstable colorectal cancers.

Int J Cancer. 2010 Mar 2. [Epub ahead of print]

Linnebacher M, Gebert J, Rudy W, Woerner S, Yuan YP, Bork P, von Knebel Doeberitz M. Frameshift peptide-derived T-cell epitopes: a source of novel tumor-specific antigens. Int J Cancer. 2001 Jul 1; 93 (1): 6-11.

Reuschenbach M, Waterboer T, Wallin KL, Einenkel J, Dillner J, Hamsikova E, Eschenbach D, Zimmer H, Heilig B, Kopitz J, Pawlita M, von Knebel Doeberitz M, Wentzensen N. Characterization of humoral immune responses against pl6, p53, HPV16 E6 and HPV16 E7 in patients with HPV-associated cancers.

Int J Cancer. 2008 Dec 1; 123 (11): 2626-31.

Reuschenbach M, Kloor M, Morak M, Wentzensen N, Germann A, Garbe Y, Tariverdian M, Findeisen P, Neumaier M, Holinski-Feder E, von Knebel Doeberitz M. Serum antibodies against frameshift peptides in microsatellite unstable colorectal cancer patients with Lynch syndrome.

Fam Cancer. 2009 Dec 2. [Epub ahead of print]

Ripberger E, Linnebacher M, Schwitalle Y, Gebert J, von Knebel Doeberitz M. Identification of an HLA-A0201-restricted CTL epitope generated by a tumor-specific frameshift mutation in a coding microsatellite of the OGT gene. J Clin Immunol. 2003 Sep; 23 (5): 415-23.

Schwitalle Y, Kloor M, Eiermann S, Linnebacher M, Kienle P, Knaebel HP, Tariverdian M, Benner A, von Knebel Doeberitz M. Immune response against frameshift-induced neopeptides in HNPCC patients and healthy HNPCC mutation carriers. Gastroenterology. 2008 Apr; 134(4): 988-97.

Schwitalle Y, Linnebacher M, Ripberger E, Gebert J, von Knebel Doeberitz M. Immunogenic peptides generated by frameshift mutations in DNA mismatch repair-deficient cancer cells. Cancer Immun. 2004 Nov 25; 4:14.