Результат интеллектуальной деятельности: Способ отбора и подготовки пробы клеток конъюнктивы для проведения бактериологического, вирусологического и иммунологического исследований

Изобретение относится к отбору проб, в частности к отбору и подготовке пробы клеток конъюнктивы для проведения бактериологического, вирусологического и иммунологического исследований в области медицины (офтальмологии), и может быть использовано для проведения бактериологического, вирусологического и иммунологического исследований с целью выявления этиологии воспалительных заболеваний переднего отрезка глаза.

Отбор пробы и лабораторная диагностика при воспалительных заболеваниях переднего отрезка глаза является необходимым условием в определении тактики лечения пациента, а также контроля и прогнозирования изменений показателей локального иммунитета под влиянием лекарственных препаратов. В настоящее время основным материалом для проведения бактериологического, вирусологического, биохимического и иммунологического исследований в офтальмологии является слезная жидкость (патент №2165082, опубл. 2000 г.; Стукалов С.Е. Иммунологические исследования в офтальмологии. - Воронеж, 1975. - 224 с.; Пучковская Н.А., Шульгина Н.С., Минев М.Г., Игнатов Р.К. Иммунология глазной патологии. - М: Медицина, 1983. - 208 с.).

Однако получение пробы не всегда представляется возможным у пациентов со сниженной слезопродукцией, наличием роговично-конъюнктивального ксероза. Следует отметить, что воспалительные заболевания переднего отрезка глаза практически в 100% случаев осложняются развитием синдрома сухого глаза (Майчук Д.Ю. и др. «Синдром красного глаза», М., 2010. - 108 с.) и затрудняет получение достаточного количества материала для проведения исследования. Кроме того, определение экспрессии генов различных биологически активных веществ (в т.ч. цитокинов), исследование латентной внутриклеточной инфекции более информативно проводить на клеточном материале.

Отбору проб - забору конъюнктивальных клеток с целью проведения цитологического исследования и верификации диагноза «синдром сухого глаза» посвящены единичные работы.

Отбор и подготовка пробы - изъятие материала осуществляется с помощью фильтровальной бумаги либо специальными приборами с последующей оценкой клеточного состава методом импрессионной цитологии (Vadrevu V.L. et al. Enhancement to the cjnjunctival impression cytology technique and examples of applications in a clinico-biocheical study of dry eye. - CLAO J., 1994. - Vol. 20; №1. - P. 59-63; Singh R. et al. Impression cytology of the ocular surface. - Br. J. of Ophthalmol, 2005. - Vol. 89; №7. - P. 1655-1659). Предложенные методы забора клеток конъюнктивы связаны либо с недостаточным количеством клеточного материала, необходимого для проведения исследования, либо с малой доступностью приборов, либо с трудоемкостью подсчета клеток в пробе.

Как правило, подсчет клеток конъюнктивы в пробе производится при помощи светового микроскопа, что является субъективным и достаточно трудоемким методом. В последнее время в различных областях медицины применяют счетчики клеток (в гематологии для подсчета форменных элементов крови, в паразитологии для определения количества личинок в крови и др.) (PLoSNeglTropDis. 2014 Sep 18; 8(9):е3180. doi: 10.1371/journal.pntd.0003180. eCollection 2014. Repurposed automated handheld counter as a point-of-care tool to identify individuals ‘at risk’ of serious post-ivermectin encephalopathy. Bennuru S1, Pion SD2, Kamgno J3, Wanji S4, Nutman TB1.). Счетчики определяют не только количество клеток в образце, но и их размеры и объем, что позволяет предположить о виде клеточной структуры. Подобные приборы позволяют автоматизировать подсчет клеток, определение их размеров и объема, что исключает субъективный фактор и возможность получения ошибочных данных, а также упрощает процедуру и позволяет получить результаты в короткий срок.

Таким образом, приведенные данные обусловливают актуальность оптимизации отбора пробы путем взятия клеточного материала конъюнктивы, а именно разработку метода взятия клеточного материала конъюнктивы с дальнейшим подсчетом клеток при помощи автоматизированного счетчика с целью стандартизации метода забора и использования его для лабораторной диагностики инфекционных заболеваний и иммунологических исследований при воспалительной патологии глазной поверхности.

Из уровня техники известен стандарт в сборе материала при импрессионной цитологии. Таким стандартом является методика Kruse F.E. (Brewitt Н., Zierhut М. Trockenes Auge: Anatomie, Physiologie, Pathophysiologic, Diagnostik, Therapie. / H. Brewitt, M. Zierhut (Hrsg.). - Heilderberg: Kaden, 2001. - 180 p.). Для сбора материала эпителиальных клеток используется целлюлозно-ацетатный фильтр (Millipore VSWP 0,025 mm). Диск из целлюлозно-ацетатного фильтра вырезают по шаблону соответственно площадке грузика, то есть 4 на 6 мм., упаковывают в индивидуальные эпендорфы для стерилизации и прикрепляют клейкой стороной к тонометру. Диском из целлюлозно-ацетатного фильтра надавливают на бульбарную конъюнктиву в течение несколько секунд после инстилляций местных анестетиков. Готовый препарат покрывают полистиролом и покровным стеклом и изучают методом световой микроскопии при увеличении 150-300.

Недостатки данного аналога - неудобен и длителен.

Известен способ подготовки пробы клеток конъюнктивы к цитологическому исследованию (прототип), включающий соскоб эпителия бульбарной конъюнктивы для диагностики изменений конъюнктивы глазного яблока патент 2282843 С2, G01N 1/30, опубл. 2006 г. Пробу берут расслаивателем (ALKON) после предварительной местной анестезии раствором 0,5% дикаина и наносят на поверхность чистого обезжиренного предметного стекла, высушивают естественным путем, фиксируют 96% этиловым спиртом, окрашивают по Романовскому-Гимзе, затем краску смывают проточной водой, соскобы высушивают естественным путем. Цитологические препараты микроскопируют.

Недостатком прототипа является его инвазивность и риск повреждения конъюнктивы: перфорация конъюнктивы, кровоизлияние. А раствор дикаина, используемый в данном способе, является токсичным.

Техническим результатом изобретения является упрощение способа подготовки клеток конъюнктивы и уменьшение инвазивности способа. Кроме того, повышается достоверность (стандартизация) отбора пробы.

Таким образом, решается важная техническая задача - разработка и стандартизация метода отбора пробы и взятия клеточного материала с конъюнктивы нижнего века для проведения ряда исследования (вирусологических, бактериальных, цитологических, иммунологических) при диагностике заболеваний.

Технический результат достигается тем, что способ отбора и подготовки пробы клеток конъюнктивы для проведения бактериологического, вирусологического и иммунологического исследований включает забор материала зондом в области наибольшей плотности клеток при оттягивании нижнего века путем движения петлей по конъюнктиве нижнего века, нижней переходной складке и в области слезного мясца не менее чем двумя скользящими движениями, после чего материал помещают в пробирку с 0,1 мл физиологического раствора, перемешивают, отстаивают при комнатной температуре не менее 4 часов перед проведением анализа пробы и осуществляют забор и помещение пробы в камеру наконечника ручного автоматизированного счетчика клеток.

Забор материала поводят после местной анестезии раствором проксиметакаина.

Раскрытие изобретения

Забор материала осуществляется зондом (например, производства ООО «Центромед», Москва), после местной анестезии раствором проксиметакаина («Алкаин», Алкон, США). Необходимо оттянуть нижнее веко и провести петлей по конъюнктиве нижнего века, нижней переходной складке и в области слезного мясца двумя-тремя легкими, скользящими движениями, как показано, например, на фото 1, 2, 3. Взятие клеточного материала в области конъюнктивы нижнего века обусловлено тем фактом, что плотность клеток в данной области самая высокая.

После забора материал помещают в пробирку с 0,1 мл физиологического раствора, перемешивают и перед проведением анализа пробы отстаивают при комнатной температуре 4 часа.

Подготовленную суспензию клеток помещают в ручной автоматизированный счетчик клеток Scepter™Millipore™ (Германия) путем забора образца в камеру 1, встроенную в наконечник 2 прибора 3 (фиг. 1).

Далее осуществляется автоматический подсчет клеток, определение их объема и диаметра. В основе работы прибора лежит принцип Культера (импедансометрии): измеряется импульс электрического напряжения, возникающий при прохождении частицы (эукариотической клетки) через трубку (ампулу) малого диаметра из непроводящего материала. Импульс напряжения возникает в результате увеличения сопротивления между электродами в момент, когда частица (клетка), увлекаемая потоком токопроводящей жидкости, проходит сквозь ампулу, при этом величина (амплитуда) импульса пропорциональна объему частицы. Автоматический счет числа импульсов и сортировка их по амплитудам позволяют получать кривые распределения частиц по размерам.

Забор материала (клетки конъюнктивы) вышеуказанным способом осуществляли у здоровых добровольцев (n=30) и у пациентов с острым конъюнктивитом (n=30). При помощи счетчика клеток Scepter^TM Millipore^TM определяли концентрацию клеток в 1 мл суспензии, диаметр клеток (мкм) и объем клеток (пл). Подсчет средних значений показателей осуществляли при помощи компьютерной программы SPSS Statistics версии 20. Средняя концентрация клеток в 1 мл образца у здоровых добровольцев составила 3,76±3,04, у пациентов с острым конъюнктивитом - 3,94±4,02, при этом р-уровень значимости различий превышает 0,9, следовательно, разница средних значений недостоверна (таблица 1). По другим параметрам счетчика нет разницы, это говорит о том, что количество клеток одно и то же (не важно здоровый глаз или больной), следовательно, метод можно признать стандартизированным.

Сравнение средних значений диаметра клетки и объема клетки между двумя группами также не выявило значимых различий (р=0,691 и p=0,721 соответственно) (таблица 1). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что такие показатели, как концентрация клеток в образце, их диаметр и объем у здоровых добровольцев и у пациентов с воспалением слизистой оболочки глаза не имеют значимых отличий. Следовательно, забор конъюнктивальных клеток конъюнктивы нижнего века при помощи универсального зонда можно считать стандартизированным и использовать в проведении лабораторной диагностики у пациентов с воспалительными заболеваниями переднего отрезка глаза.

Предлагаемый метод получения конъюнктивальных клеток был использован у пациентов с острым конъюнктивитом (n=30) с целью выявления возбудителя заболевания и определения экспрессии генов цитокинов до начала терапии и спустя 7 дней от начала терапии.

Приводим примеры клинического использования.

Пример 1. Пациентка Д., 27 лет, обратилась в отделение неотложной помощи филиала №1 ГКБ им. С.П. Боткина с жалобами на покраснение правого глаза, слезотечение. Из анамнеза: жалобы появились 2 дня назад на фоне полного здоровья, отметила попадание пыли в глаза накануне появления симптомов заболевания. Было проведено обследование: биомикроскопия бульбарной конъюнктивы, конъюнктивы век и переходных складок, роговицы, бесконтактная тонометрия. Поставлен диагноз: OD - острый конъюнктивит неясной этиологии. Проведено бактериологическое и вирусологическое (определение ДНК аденовируса, герпесвирусов, РНК энтеровируса) исследование конъюнктивального мазка, взятого вышеуказанным способом в день первого обращения и на 7 сутки после назначенной терапии (антибактериальной, противовоспалительной). Бактериологическое исследование проводили при помощи метода полимеразной цепной реакции, вирусологическое - методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с количественным определением содержания патогена в конъюнктивальном мазке. Результаты исследований: в конъюнктивальном мазке пациентки обнаружена гемофильная палочка (Н. Influenza) - абсолютный патоген, в концентрации 4000 коп/мл и метициллинрезистентные коагулазонегативные стафилококки (англ. MRCoNS) - условные патогены, а также возможные представители нормальной микрофлоры конъюнктивы, в концентрации менее 2200 коп/мл. На 7 сутки от начала терапии признаки воспаления конъюнктивы (отек, гиперемия) отсутствовали, в конъюнктивальном мазке обнаруживали MRCoNS в концентрации менее 800 коп/мл.

Пример 2. Пациент Н., 36 лет, обратился в отделение неотложной помощи филиала №1 ГКБ им. С.П. Боткина с жалобами на покраснение обоих глаз, слезотечение, светобоязнь. Из анамнеза: жалобы появились 3 дня назад, сначала покраснел правый глаз, через сутки - левый и присоединились явления ринита и фарингита. Температура тела повысилась до 38,0°. Было проведено обследование: биомикроскопия бульбарной конъюнктивы, конъюнктивы век и переходных складок, роговицы, бесконтактная тонометрия. Поставлен диагноз: OU - острый конъюнктивит предположительно аденовирусный. Проведено бактериологическое и вирусологическое исследование конъюнктивального мазка вышеуказанными способами в день первого обращения и на 7 сутки терапии (антибактериальной, противовирусной, противовоспалительной). Результаты исследований: в конъюнктивальном мазке пациента обнаружена ДНК аденовируса и метициллинрезистентный золотистый стафилококк (англ. MRSA) - в малой концентрации - менее 900 коп/мл. При повторном обращении (7 сутки от начала терапии) пациент отмечал улучшение состояния. Объективно наблюдали снижение интенсивности симптомов воспаления, ДНК аденовируса не обнаруживали, при проведении бактериологического исследования выявили MRSA менее 800 коп/мл.

Иммунологическое исследование. Иммунологическое исследование конъюнктивального мазка проводили путем определения матричной РНК (мРНК) 21 цитокина (интерферон-α (ИФН-α), ИФН-β, ИФН-γ, ИФН-λ1, ИФН-λ2, ИФН-λ3, интерлейкин-1β (ИЛ-1β), ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-17, ИЛ-18, фактор некроза опухолей-α (ФНО-α), сосудистый эндотелиальный фактор роста А (СЭФР-А), СЭФР-С, СЭФР-R1, СЭФР-R2, СЭФР-R3) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Пример 3. Пациентка С., 46 лет, обратилась в отделение неотложной помощи филиала №1 ГКБ им. С.П. Боткина с жалобами на покраснение обоих глаз, слезотечение, светобоязнь. Из анамнеза: жалобы появились 2 дня назад на фоне субфебрильной температуры и катаральных явлений. Было проведено обследование: биомикроскопия бульбарной конъюнктивы, конъюнктивы век и переходных складок, роговицы, бесконтактная тонометрия. Поставлен диагноз: OU - острый конъюнктивит предположительно аденовирусный. Проведено иммунологическое исследование конъюнктивального мазка в день первого обращения и на 7 сутки терапии (антибактериальной, противовирусной, противовоспалительной). Результаты исследований: при первом обращении в конъюнктивальном мазке определены мРНК ИФН-γ, ИЛ-18, ФНО-α. На 7 день от начала терапии на фоне снижения интенсивности симптомов воспаления экспрессии генов цитокинов не выявлено.

Пример 4. Пациент Д., 35 лет, обратился в отделение неотложной помощи филиала №1 ГКБ им. С.П. Боткина с жалобами на покраснение правого глаза, отек век, гнойное отделяемое. Из анамнеза: жалобы появились 4 дня назад на фоне полного здоровья. Со слов пациента - «потер глаз грязной рукой». Было проведено обследование: биомикроскопия бульбарной конъюнктивы, конъюнктивы век и переходных складок, роговицы, бесконтактная тонометрия. Поставлен диагноз: OU - острый гнойный конъюнктивит неясной этиологии. Проведено иммунологическое исследование конъюнктивального мазка в день первого обращения и на 7 сутки терапии (антибактериальной, противовоспалительной). Результаты исследований: при первом обращении в конъюнктивальном мазке определены ФНО-α, СЭФР-R1, СЭФР-R3. На 7 день от начала терапии на фоне снижения интенсивности симптомов выявляли экспрессию генов ИФН-α.