Результат интеллектуальной деятельности: Способ диагностики послеродового эндометрита с помощью ОТ-ПЦР

1. Область техники.

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, гинекологии, иммунологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для оптимизации диагностики и лечения эндометрита в послеродовом периоде, основываясь на определении состояния локального иммунитета.

2. Уровень техники.

Принимая во внимание рост числа послеродовых инфекционно-воспалительных осложнений, трудность в прогнозировании и верификации диагноза, поиск новых маркеров диагностики послеродового эндометрита представляет актуальную проблему в акушерстве. Послеродовый эндометрит в общей популяции родильниц составляет 3-8%, а среди больных с послеродовыми воспалительными осложнениями более 40%.

Приводимые различными исследователями статистические данные частоты послеродового эндометрита свидетельствуют об отсутствии единого подхода к постановке диагноза и определению критериев гнойного осложнения, благодаря которым можно было бы четко дифференцировать стертую и классическую формы ПЭ, классический послеродовой эндометрит и синдром системного воспалительного ответа.

В последние годы отмечается увеличение числа родильниц со стертым течением ПЭ, имеющих высокий риск генерализации инфекции. Трудности определения степени тяжести воспалительного процесса определяют потребность в достоверных диагностических критериях.

Ранее некоторые авторы проводили исследования для выявления различных маркеров развития ПЭ. Так, для выявления эндометрита после кесарева сечения С.Б. Крюковский и соавт. (1998 г.) определяли уровень активности интерлейкина-1 (ИЛ-1) в маточных лохиях. Выявлено, что высокая активность ИЛ-1 в лохиях может быть маркером эндометрита. Но данный метод не нашел широкого применения. У родильниц всегда имеются предрасполагающие факторы инфекционного риска, так как внутренний слой послеродовой матки представляет собой раневую поверхность, а содержимое (лохии) ее полости является благоприятной средой для развития микроорганизмов.

Возникновение и развитие послеродовых инфекций зависит от взаимодействия двух основных систем - макро- и микроорганизма. Чаще всего указанная патология возникает при инфицировании на фоне снижения иммунологической реактивности организма после родов. При этом наряду с вирулентностью возбудителей, массивностью заражения, состоянием входных ворот и первичного очага инфекции решающее значение в реализации воспалительного процесса имеет уровень иммунологической толерантности женского организма (Мешалкина И.В., 2010 г.).

Развивающаяся при начальном этапе воспаления острофазовая реакция контролируется провоспалительными медиаторами (интерлейкинами ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, фактором некроза опухоли (ФНО) и др) и их эндогенными антагонистами, такими как ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, растворимые рецепторы к ФНО и др., получившими название антивоспалительных медиаторов. За счет поддержания баланса и контролируемых взаимоотношений между про- и антивоспалительными медиаторами в нормальных условиях создаются предпосылки для заживления ран, уничтожения патогенных микроорганизмов, поддержания гомеостаза. При выраженном воспалении или его системной несостоятельности некоторые виды цитокинов ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-10, ИФН-у (при вирусных инфекциях) могут проникать в системную циркуляцию, накапливаться там в количествах, достаточных для реализации своих дистантных - эндокринных эффектов. В случае неспособности регулирующих систем к поддержанию гомеостаза деструктивные эффекты цитокинов и других медиаторов начинают доминировать, что приводит к нарушению проницаемости и функции эндотелия капилляров, запуску синдрома ДВС, формированию отдаленных очагов системного воспаления, развитию моно- и полиорганной дисфункции. В качестве факторов системного повреждения, по-видимому, могут выступать и любые нарушения гомеостаза, способные восприниматься иммунной системой как повреждающие или потенциально повреждающие.

Установление более точных маркеров, описывающих состояние локального иммунитета, является крайне актуальным.

Задачей настоящего изобретения является оценка транскрипционного профиля содержимого лохий с целью оптимизации диагностики послеродового эндометрита и, таким образом, усовершенствовать существующие критерии диагностики инфекционно-воспалительных осложнений в послеродовом периоде; уточнить и дополнить современные диагностические алгоритмы послеродовых инфекционных осложнений.

Эта задача решается путем молекулярно-генетического исследования уровня экспрессии мРНК генов провоспалительных цитокинов, с применением метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), что позволяет неинвазивно и комплексно подходить к диагностике и, следовательно, к своевременному лечению.

3. Реализация изобретения

3.1. Взятие материала

На 3 сутки родильницам, включенным в исследование, производился забор материала (содержимое лохий) в одноразовые пробирки. Во избежание деградации РНК взятие материала (содержимое лохий родильниц) осуществляли в пробирки с раствором гуанидинтиоцианата (лизирующий раствор наборы «Проба НК» («ДНК-Технология», Россия)). В работе использовались коммерческие реактивы («ДНК-Технология», Россия). Производитель гарантировал отсутствие амплификации на матрице геномной ДНК цитокинов и референсных генов. Это позволило не использовать дополнительный этап обработки нуклеиновых кислот ДНК-азой.

Выделение РНК проводили с использованием наборов «Проба НК» согласно инструкции производителя. Метод основан на лизисе клеток в растворе гуанидинтиоцианата и последующем спиртовом осаждении тотальной РНК и ДНК. Осаждение РНК проводили изопропанолом в присутствии соосадителя, с последующими отмывками промывочными растворами. Объем образцов после выделения составил 50 мкл.

Реакцию обратной транскрипции ставили в объеме 40 мкл (в реакцию брали 33 мкл образца). В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали специфические олигонуклеотиды. Реакцию проводили при температуре 40°С в течение 30 мин, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95°С в течение 5 минут. Для увеличения объемов образцов после ОТ кДНК разводили в 10 раз в ТЕ-буфере.

Амплификацию осуществляли в режиме реального времени в объеме 35 мкл по следующей программе: 1 цикл - 80°C 30 с, 94°С 1 мин 30 с; 50 циклов - 94°C 20 с, 64°C 20 с; 10°C - хранение 94°C на приборе «ДТ-964» («ДНК-Технология», Россия). Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 64°C по каналу FAM. Реакцию ставили в двух повторах для каждой точки. Уровень экспрессии мРНК измеряли в относительных единицах относительно нормировочного фактора, рассчитанного на основе уровня экспрессии трех референсных генов ТВР, В2М, GUSB. Использован метод сравнения индикаторных циклов (метод ΔCq).

Статистическую обработку результатов исследования уровней экспрессии мРНК генов цитокинов проводили с использованием методов непараметрического анализа. Исследованные количественные показатели представлены в виде Me (1Q-3Q), где Me - медиана, 1Q - нижний квартиль, 3Q - верхний квартиль. Для сопоставления двух групп по количественным признакам использован U-критерий Манна-Уитни. Различие между группами полагали статистически значимым при p<0,05. Обработку полученных результатов проводили в программном пакете StatSoft Statistica 6.0, SPSS Statistics версия 17.0.

Для дискриминации и выявления образцов содержимого лохий женщин с послеродовым эндометритом использован метод многофакторного анализа (бинарная логистическая регрессия). Значение точки cut off выбрано с помощью ROC-анализа, критерий выбора - максимальная суммарная чувствительность и специфичность.

3.2 Описание изобретения.

Предложен способ диагностики послеродового эндометрита по соотношению уровня представленности транскриптов (мРНК) генов фактора некроза опухоли α (TNF) и факторов дифференцировки лейкоцитов CD45, CD69, CD166. Данные показатели выбраны после исследования в материале содержимого лохий широкого спектра генов цитокинов 1L1B, A, IL4, IL7, IL6, IL8, IL18, IL21, IL10, IFNG, толл-подобных рецепторов TLR2, TLR4, TLR7, TLR9, кластеров дифференцировки лейкоцитов CD45, CD68, CD69, CD56, CD31, CD166, а также транскрипционного фактора GATA3.

Исследование профиля мРНК генов иммунного ответа в отторгающихся тканях эндометрия (содержимое лохий) с помощью метода количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени, согласно расчету объема выборки, проведено у 57 женщин: 1 группа включала 17 пациенток с ПЭ, 2 группа сравнения - 40 условно-здоровых женщин, у которых послеродовый период протекал без осложнений.

У пациенток с развитием послеродового эндометрита выявлено повышение уровня экспрессии мРНК генов TNF в 3,8 раз (p=0,020), IL1B в 2,7 (р=0,053), TLR2 в 2,6 (р=0,047), CD45 в 2 раза (р=0,007), IL10 в 1,7 (р=0,037) по сравнению с группой сравнения, у которой послеродовый период протекал без осложнений (фиг. 1). В то же время у женщин 1 группы отмечалось снижение экспрессии мРНК гена CD166 в 2,1 раза (p=0,007) и тенденция к снижению IL18 в 4,5 раза (p=0,064).

В ходе многофакторного анализа рассчитанных далее уровней соотношения транскриптов установлены наиболее информативные показатели определения воспалительного процесса в эндометрии:

соотношения уровней транскриптов , и .

Уравнение дискриминирующей (классифицирующей) функции имеет:

(формула 1), где , и - соотношение уровней экспрессии мРНК соответствующих генов, рассчитанное с помощью метода сравнения пороговых циклов (ΔСр).

Далее рассчитывается индекс воспаления (ИВ) по формуле:

ИВ=1/(1+e^-z)*100% (формула 2), где

z - значение классифицирующей функции, рассчитанное по формуле 1.

Выбор порога отсечки положительного результата определен с помощью ROC-анализа с выбором наибольшей суммарной чувствительности и специфичности метода. Площадь под ROC-кривой составила AUC=90,6±4,2 (p=1,5*10^-6) (фиг. 2), оптимальное пороговое значение cut off=51%.

Распределение образцов по группам в зависимости от значения индекса воспаления представлены на фиг. 3. Из 40 образцов содержимого лохий женщин, у которых послеродовый период протекал без осложнений, в одном случае значение ИВ превышало 51%. Из 17 образцов содержимого лохий женщин с послеродовым эндометритом в 14 случаях значение ИВ превышало 51%.

Чувствительность и специфичность предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции в полости матки на основе определения транскрипционной активности генов иммунного ответа при выбранном значении cut off составили 76,5% и 97,5% соответственно.

Таким образом, повышение уровня экспрессии провоспалительных цитокинов TNF, IL1B, TLR2 и CD45 говорит об активации врожденного иммунитета, который является самым ранним ответом организма на воспаление и в свою очередь запускает механизмы ответа со стороны иммунной системы в целом. С учетом особенностей транскрипционного профиля генов иммунного ответа в материале содержимого лохий женщин с послеродовым эндометритом разработан критерий интегральной оценки соотношения уровня экспрессии 4 маркеров: , и , который может быть использован для диагностики послеродового эндометрита. Индекс воспаления рассчитывают по формулам 1 и 2. При значении индекса воспаления более 51% делают заключение о высокой вероятности развития послеродового эндометрита, при значении индекса воспаления ≤51% делают заключение об отсутствии послеродового эндометрита.

3.4. Пример использования изобретения.

Пример 1. Пациентка М., 28 лет: 1 своевременные оперативные роды. В анамнезе 2012 г. - самопроизвольный выкидыш, по поводу чего произведено выскабливание стенок матки.

По данным клинико-лабораторных параметров риск развития ПЭ был высоким в связи с наличием факторов риска: проведение экстренной операции в связи с клинически узким тазом, длительный безводный промежуток (13 часов) и продолжительность родов 10 часов.

На 3 сутки был произведен забор лохий, методом количественной ОТ-ПЦР выполнено исследование уровня экспрессии мРНК генов TNF, CD45, CD68 и CD166. Индекс воспаления составил 69,8%, что говорило о высоком риске развития ПЭ. На 4 сутки впервые проявились признаки ПЭ: гипертермия (температура тела выше 38°C), изменение характера лохий (появление неприятного ихорозного запаха и мутный цвет), а также симптомы интоксикации (слабость, апатия, отсутствие аппетита). По данным клинико-лабораторного обследования: лейкоцитоз - 16,29×10⁹/л и нейтрофильный сдвиг (нейтрофилы 89,7%), уровень C-реактивного белка - 155,5 мг/л. Начато проведение антибактериальной терапии (амоксициллин/клавулановая кислота 1,2 г×3 р/д в/в), инфузионной и симптоматической терапии. На 2 сутки от начала антибиотикотерапии произошла замена антибактериальных препаратов в связи с их неэффективностью на комбинацию аминогликозида и линкозамида. На фоне проводимой терапии состояние пациентки улучшилось. Пациентка выписана в удовлетворительном состоянии.

Представленный клинический пример показывает, что у пациентки высокий уровень экспрессии TNF, CD45, CD69 и выраженное снижение CD166 прогнозировало развитие эндометрита еще до развития клинических признаков, что способствовало своевременному началу лечения и получению удовлетворительных результатов.

Пример 2.

Пациентка Н., 32 лет: 1 своевременные самопроизвольные роды. В анамнезе 2010 г. - неразвивающаяся беременность, по поводу чего произведено выскабливание стенок матки. Наличие хронического эндометрита и сальпингоофорита и перенесенный ранее хламидиоз увеличивали риск развития ПЭ.

На 3 сутки был произведен забор лохий, Индекс воспаления составил 33,3%, что свидетельствовало о низком риске развития ПЭ. По данным клинико-лабораторного обследования отмечался лейкоцитоз - 17,41×10⁹/л без выраженного нейтрофильного сдвига (нейтрофилы 70,1%), уровень С-реактивного белка - 133,2 мг/л. По данным ультразвукового исследования полости матки на 3 сутки отмечались признаки субинволюции (расширение полости матки до 3,5 см). На 4 сутки у пациентки однократно отмечался подъем температуры до 37,8°C без проявления других признаков инфекционного процесса.

В связи с полученными данными было решено воздержаться от проведения антибактериальной терапии. В контрольном клиническом анализе крови отмечалась нормализация уровня лейкоцитов - 10,12×10⁹/л, нейтрофилов - 68%. По данным динамического УЗ-наблюдения эхографические параметры были в пределах нормативных значений. Пациентка выписана в удовлетворительном состоянии.

Представленный клинический пример показывает, что принятие во внимание низкого уровня экспрессии TNF, CD45, CD69 и высокого уровня CD166, что не прогнозирует развитие эндометрита, позволило избежать нерационального использования антибактериальной терапии.

Источники информации

1. Актуальные проблемы антимикробной терапии и профилактики инфекций в акушерстве, гинекологии и неонатологии / В.И. Кулаков и др. // Акушерство и гинекология. 2004. - №1. - С. 3-6.

2. Белокриницкая Т.Е. Состояние защитных систем и их коррекция при эндометритах после родов и кесарева сечения / Т.Е. Белокриницкая, Ю.А. Витковский. - Чита: Поиск, 1999. 103 с.

3. Мешалкина И.В. Плазмоферез в комплексной терапии послеродового эндометрита // диссертация. 2010 г. Москва.

4. Deborah S. Yokoe, Cindy L. Christiansen, Ruth Johnson. Epidemiology of and Surveillance for Postpartum Infections. Boston, MA, USACJ. 2010 г.

5. 73. Deborah Brandt Karsnitz, CNM, DNP. Puerperal Infections of the Genital Tract: A Clinical Review, 2012 г.

6. Henderson E. Incidence of hospital infections associated with cesarean section / E. Henderson // J. Hosp. Infect. - 1995. Vol. 29, №4. - P. 245-255.

7. Karsnitz D.B. Puerperal infections of the genital tract: a clinical review. J. Midwifery Womens Health. 2013 Nov-Dec; 58(6): 632-42. doi: 10.1111/jmwh.l2119.

8. Tharpe N. Postpregnancy genital tract and wound infections. J. Midwifery Womens Health. 2008; 53(3): 236-246.

9. Sweet R.L, Gibbs R.S. Infectious diseases of the female genital tract (5th ed). Baltimore, Maryland: Lippincott Williams & Wilkins. / R.I. Sweet. 2009 - P. 579-601.

10. Tharpe N. Postpregnancy genital tract and wound infections. J. Midwifery Womens Health. 2008; 53(3): 236-246.

11. Yaegashi Y, Shirakawa K, Sato N, Suzuki Y, Kojika M, Imai S, et al. Evaluation of a newly identified soluble CD 14 subtype as a marker for sepsis. J Infect Chemother 2005; 11: 234-8. http://dx.doi.org/10.1007/s10156-005-0400-4.

Описание фигур

Фиг. 1. Локальный транскрипционный профиль генов иммунного ответа родильниц на 3 сутки послеродового периода.

Фиг. 2. ROC-кривая точки cut off положительного результата наличия воспалительного процесса в полости матки в послеродовом периоде.

Фиг. 3. Распределение значений индекса воспаления в группах исследования.