Штамм микроорганизма Clonostachys rosea f. catenulata в качестве биофунгицида, стимулятора роста растений и продуцента метаболитов для сельскохозяйственного применения

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и сельскому хозяйству и представляет собой штамм микроорганизма Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324, используемый для защиты сельскохозяйственных растений от различных заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами и бактериями, а также в качестве стимулятора роста растений и продуцента метаболитов для сельскохозяйственного применения.

Микроорганизмы Clonostachys rosea f. catenulata известны с одной стороны в качестве деструктора поливинилового спирта. Из уровня техники известен документ RU 2415915 С1, 10.04.2011, в котором описан штамм Clonostachys rosea f. catenulata (J.C. Gilman et E.V. Abbott) Schroers ВКПМ F-991, используемый в качестве биодеструктора поливинилового спирта.

С другой стороны, известно, что микроорганизмы вида Clonostachys rosea f. catenulata используют в сельском хозяйстве. Известно использование для улучшения роста растений, например, в составе композиций, содержащих помимо микроорганизма также мульчу (см. WO 2014076663 А1, 22.05.2014).

Из уровня техники известны фунгицидные смеси на основе азолопиримидиниламинов, в которых в качестве противогрибковых агентов биологического контроля, биоактиваторов растений используют штамм, или бесклеточный экстракт, и/или мутант этого штамма или экстракта, имеющий все отличительные характеристики соответствующего штамма или экстракта Clonostachys rosea f. catenulata (WO 2011/117271, 29.09.2011).

Из уровня техники известно также использование других видов данного микроорганизма. Так, известен штамм Clonostachys rosea f. rosea, IDAC 040913-01, который подавляет или контролирует заболевание или патоген, которые поражают листья, цветы, плоды и/или корни растения (WO 2015/035504, 19.03.2015). В данном документе описана также композиция, включающая выделенную культуру данного штамма, способ обработки растения агентом биологической защиты, включающий контактирование растения с выделенной культурой, спорами гриба или указанной композицией, способ уменьшения порчи растительного материала, где способ включает контактирование растительного материала с выделенной культурой, спорами гриба или композицией.

Штамм Clonostachys solani f. nigrovirens (van Beyma) Schroers ВКПМ F-990 известен как биодеструктор термопластичного полиуретана и латекса на основе акриловой кислоты (RU 2415917 С1, 10.04.2011).

Задачей же настоящего изобретения является получение высокоэффективного штамма для использования в сельском хозяйстве для защиты сельскохозяйственных растений от различных заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами и бактериями, для ускорения роста и развития растений, для увеличения урожайности и качества продукции, а также для получения используемых в сельском хозяйстве ценных метаболитов, таких как аминокислоты и фитогормоны.

Авторами настоящего изобретения был выделен штамм Clonostachys rosea f. catenulata, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ-F1324.

Штамм выделен из ризосферы хлопчатника в Ташкентской области.

Культурально-морфологические признаки штамма

Колонии на сусло-агаре вначале белые, опушенные, со временем приобретающие серо-зеленоватый цвет) с концентрической зональностью, реверс светло-желтый. Конидиеносцы по периферии колонии вертициллоидного типа, с широко расходящимися фиалидами, в центре преобладают конидиеносцы пенициллоидного типа с более плотно сжатыми фиалидами, двух- и трехъярусные, конидии овальные) в длинных цепочках, слизистые.

Растет в аэробных условиях. Хороший рост при 10…30°С, растет в широких пределах рН от 3,0 до 9.

Для штамма характерен хороший рост и спороношение при выращивании на агаровых средах - сусло-агар, картофельно-сахарозная среда, среда Чапека, крахмально-соевая, среда из отвара отрубей.

Спорообразование начинается на пятый день роста при 24…26°С.

Линейный рост колонии на агаризованных средах

На сусло-агаровой среде на чашках Петри - на 10-й день роста - размером в 50 мм, на 20-й день - 80 мм.

На картофельном агаре на 14-й день роста - 45 мм, на 20-й день 90 мм.

На агаровой среде Чапека с сахарозой на 12-й день роста - 45 мм, на 20-й день - 85 мм.

При глубинном культивировании на минеральных и органических средах штамм растет в виде гомогенной массы бежевого или зеленого цвета.

Колонии на агаре Чапека белые, распростертые, пушистые, с конидиеносной зоной в центре колонии, оливково-зеленого или зеленого цвета, при старении темно-зеленого, разделенной 1-2 концентрическими кругами (зонами) стерильного светлого мицелия. Воздушный мицелий обильный, часто в виде гифальных тяжей. Конидиеносцы обычно однократно, иногда двукратно ветвистые, грубые, с шероховатой или точечной оболочкой 50-125 μ длины, с цепочками конидий, соединенными слизью в плотную колонку до 150 μ длины. Первичные веточки 15-20=3,5-4 μ; метули 15-25 μ, стеригмы 10-20 μ длины. Конидии эллиптические, гладкие, бледно- или темно-зеленые 4-7,5=3-4 μ.

Физиолого-биохимические свойства

При росте на среде Чапека из источников углерода усваивает глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннозу, галактозу, лактозу, рафинозу, арабинозу, сорбозу, крахмал, глицерин. Из источников азота использует нитрат Na и нитрат K, сернокислый аммоний, нитрат аммония, хлористый аммоний, аммоний фосфорнокислый однозамещенный, пептон, лейцин, лизин, аспарагин.

Штамм синтезирует

Антибиотики: глиокладин, глиоверин, виридин; ферменты: Бета-1,2-глюконазу, целлобиазу, хитиназу; аминокислоты: глутаминовую, глицин, аргинин, пролин, цистеин, меионин, орнитин, лизин, фенилаланин; ауксины: индолилмолочную, индолилуксусную, индолилкарбоновую кислоты; гиберрилиновую и абсцизовую кислоту; углеводороды, в том числе этилен.

Штамм гриба Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324 не патогенен для теплокровных животных и человека.

Были исследованы антагонистические свойства по отношению к широкому перечню фитопатогенных грибов и бактерий. Также был проведен анализ синтеза ряда метаболитов.

В ходе проведенных экспериментов было обнаружено, что в результате действия штамма существенно снижается заболеваемость растений, снимаются острые формы поражения, ускоряется развитие растений, возрастает урожай и качество продукции.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами

Изучение антагонизма активности штамма Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ ВКПМ-F1324 сравнивалось с изученными штаммами Gliocladium в чашках Петри и на газонах фитопатогенных грибов Verticillium dahliae и Fusarium oxysporum. Активность оценивали по диаметру зоны отсутствия роста тест-объекта вокруг блока антагониста и по интенсивности воздействия антагониста на газон - степени просветления газона, что отмечено плюсами.

Оценка защитного действия штаммов грибов-антагонистов проводилась на сероземной почве +2 т/га лигнина в микровегетационном опыте, где в почву совместно с антагонистами были внесены микросклероции Verticillium dahliae 0,15 г/кг. Для сравнения в опыт был включен штамм - Trichoderma B-18. Действие антагонистов на Verticillium dahliae в почве и на заражение хлопчатника вертициллезом представлено в таблице 2.

Защитный эффект Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324 оказался сильнее других штаммов Gliocladium catenulatum и Trichoderma.

Оценка фитотоксичности культуральной жидкости штамма проводилась по методике Берестецкого на семенах огурца и томата в сравнении с другими Gliocladium catenulatum 3, Trichoderma harzianum B-18, Fusarium oxysporum и Verticillium dahliae.

Результат сравнения свидетельствует о значительном стимулирующем действии на прорастание семян при их замачивании в культуральной жидкости штамма ВКПМ-F1324.

Штамм Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324 способен также проявлять антибактериальные свойства. Оценка антибактериального действия штамма Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324 проводилась на чашках Петри методом противоположных колоний со штаммом бактерии Ralstonia solanacearum. Активность оценивали по воздействию микроорганизмов друг на друга.

Через 3 дня после начала эксперимента произошло соприкосновение зон роста штамма Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324 и бактерии Ralstonia solanacearum. Рост бактерии прекратился и началось подавление Ralstonia solanacearum. Через 14 дней штамм бактерии Ralstonia solanacearum был полностью подавлен штаммом Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324.

Таким образом, штамм Clonostachys rosea f. сatenulata, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИГенетика» 18 мая 2016 года под регистрационным номером ВКПМ-F1324, может быть успешно и эффективно использован против возбудителей грибных и бактериальных болезней растений, а также для стимуляции роста растений.

Анализ фитогормонов (ауксинов, гиббереллинов, абсцизовой кислоты) в культуральной жидкости гриба.

Для экстракции ауксинов, гиббереллинов и абсцизовой кислоты брали 20 мл культуральной жидкости или стерильной питательной среды (контроль). Растворы доводили до рН=3,0 4н соляной кислотой и экстрагировали эквивалентными объемами этилацетата. Полученные экстракты выпаривали досуха под вакуумом при 350°С и растворяли в 350 мкл 18% ацетонитрила. Анализ ауксинов в полученных пробах проводили методом Ультра Производительной жидкостной хроматографии (UPLC) на системе Waters ACQUITY UPLC Н-класса (Waters, США). Анализ содержания ауксинов проводили с использованием флуоресцентного детектора при длинах волн: Ех=280 нм, Ем=350 нм. Анализ проводили на хроматографической колонке Waters ACQUITY UPLC ВЕН RP18 Shield 1,7 мкм × 50 мм в 18% растворе ацетонитрила с добавлением 0,1% уксусной кислоты при скорости потока 0,3 мл/мин. После анализа каждого образца колонку промывали 3 минуты 80% ацетонитрилом. Анализ абсцизовой и гибберелловой кислот проводился по той же методике, но с обнаружением целевого метаболита на ультрафиолетовом диодноматричном детекторе при длине волны 265 нм (абсцизовая кислота) и 208 нм (гиббереллины).

Результаты анализа представлены в таблице 4

Анализ содержания аминокислот в культуральных жидкостях.

Равные объемы культуральных жидкостей (по 50 мл) концентрировали под вакуумом на ротационном испарителе до объема 3 мл. Для определения состава аминокислот использовался современный высокочувствительный метод AccQ-Tag (Waters, США), основанный на применении дериватизационного реагента ACQ - 6-aminoquinolyl-N-hydrozysuccinimidyl carbamate, превращающего аминокислоты в стабильные флуоресцирующие производные. Полученные производные разделялись методом обращеннофазовой хроматографии на колонке С18 Waters AccQ-Tag с обнаружением на флуоресцентном детекторе согласно стандартной методике Waters. Определение содержания L-триптофана проводилось в тех же концентрированных образцах, но без обработки реактивом ACQ с обнаружением на флуоресцентном детекторе (длина волны возбуждения флуоресценции - 280 нм, длина эмиссионной волны - 350 нм).

Количество обнаруженных аминокислот представлено в таблице 5. Показано, что культуральная жидкость гриба отличается повышенным количеством глутаминовой кислоты и глицина.

Контроль - стерильная питательная среда.

GABA - гамма-аминомасляная кислота.