ПРИМЕНЕНИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА ФОТОТРОФНОЙ БАКТЕРИИ RHODOBACTER CAPSULATUS PG В КАЧЕСТВЕ ФАКТОРА, УСИЛИВАЮЩЕГО ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ 1α,25-ДИГИДРОКСИВИТАМИНА D

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии, фармакологии и медицине и может быть использовано для дальнейшей дифференцировки промоноцитов и моноцитов в клинической и экспериментальной медицине.

В качестве модельных систем для исследований механизмов дифференциации широко используются промоноцитарные клеточные линии лейкемии человека (U937 и ТНР-1). Дифференциация характеризуется изменением различных клеточных параметров клеток по сравнению с соответствующим недифференцированным фенотипом. Такие изменения касаются морфологии, метаболических процессов и роста клеток. Клетки U937 и ТНР-1 представляют собой различные этапы развития моноцитов [Tsuchiya S., Yamabe М., Yamaguchi Y., Kobayashi Y., Konno Т., Tada K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 1980. V. 26. №2. P. 171-176].

Существуют различные агенты, способные индуцировать дифференциацию клеток этих линий в зрелые моноциты. Такие агенты, как диметилсульфоксид (ДМСО) [Nakamura Т., Kharbanda S., Spriggs D., Kufe D. Effect of dexamethasone of monocytic differentiation in human U937 cells by dimethylsulfoxide. J. Cell Physiol. 1990. V. 142. P. 261-267], ретиноевая кислота [Hyodoh F. Effects of Retinoic Acid on the Differentiation of THP-1 Cell Lines Containing Aneuploid or Diploid Chromosomes. Cell structure and function. 1987. №12. P. 225-242; Olsson I.L. and Breitman T.R. Induction of differentiation of the human histiocytic lymphoma cell line U937 by retinoic acid and cyclic adenosine 3',5'-monophosphate-inducing agents. Cancer Res. 1982. V. 42. P. 3924-3927], витамин D₃ [Olsson I.L., Gullberg U., Ivhed I., Nilsson K. Induction of differentiation of the human histiocytic lymphoma cell line U937 by 1α,25-dihydroxycholecalciferol. Cancer Res. 1983. V. 43. P. 5862-5867], цитокины [Harris P.E., Ralph P., Litcofsky P., Moore M.A.S. Distinct activities of interferon, lymphokine and cytokine differentiation-inducing factors acting on the human monoblastic leukemia cell line U937. Cancer Res. 1985. V. 45. P. 9-13; Testa U., Ferbus D., Gabbianelli M., Pascucci В., Boccoli G., Louache F., Thang M.N. 1988 Effect of endogenous and exogenous interferons on the differentiation of human monocyte cell line U937. Cancer Res. 1988. V. 48. P. 82-88] и сложные форболовые эфиры, в частности 12-O-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (TPA) [Hass R., Bartels Н., Topley М., Hadam М., Kohler L., Goppelt-Strube M., Resh K. TPA-induced differentiation and adhesion of U937 cells: changes in ultrastructure, cytoskeletal organization and expression of cell surface antigens. Eur. J. Cell Biol. 1989. V. 48. P. 282-293], могут способствовать дифференциации незрелых моноцитов в моноциты/макрофаги.

Условием дифференциации в зрелые макрофаги является рост адгезии к поверхности культуральных плашек и, как следствие, резкое изменение формы клетки. Недифференцированные U937 и ТНР-1 клетки имеют округлую форму и растут в суспензии. Оба типа клеток имеют небольшую цитоплазму и крупное ядро. После дифференциации с ТРА большинство клеток прикрепляются к культуральным плашкам. Для ТНР-1 клеток характерно образование агрегатов за счет развития межклеточных псевдоподий [Panzarini Е., Ramires Р.А., Miccoli М.А., Tenuzzo В., Scordari A., Dini L. Differentiation of THP-1 and U937 cells in presence of synthetic hydrogels. Caryologia. 2006. V. 59. №4. P. 395-402].

CD14, первоначально описанный как маркер дифференцировки моноцитов, представляет собой гликопротеин массой 55 кДа. Исследования показали, что CD14 вовлекается в опосредование ответов на некоторые продукты бактериальной мембраны, особенно на липополисахариды. CD14 не обнаруживается на поверхности моноцитов-предшественников и резко возрастает во время их дифференцировки в моноциты. Таким образом, поверхностная экспрессия CD14 является отличной моделью для изучения механизмов миелоидного созревания клеток [Schwende Н., Fitzke Е., Ambs P., Dieter P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1α,25-dihydroxyvitamin D₃. J. Leukocyte Biol. 1996. V. 59. V. 555].

CR3 (β₂-интегрин, CD11b) - еще один классический маркер моноцитарной дифференциации, участвующий в клеточной адгезии, и также функционирующий как рецептор комплемента. Рецептор CD11b представляет собой гликопротеин (масса 160 кДа), который связывается нековалентно с β₂-субъединицей партнера CD18. Комплекс CD11b/CD18 экспрессируется на зрелых миелоидных клетках и широко используется в качестве раннего маркера дифференцировки моноцитов [Hmama Z., Nandan D., Sly L., Knutson K.L., Herrera-Velit P., Reiner N.E. 1999. 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃-induced myeloid cell differentiation is regulated by a vitamin D receptor-phosphatidylinositol 3-kinase signaling complex. J. Exp. Med. V. 190. P. 1583-1594].

1α,25-дигидроксивитамин D₃ (VD₃) является физиологическим агентом и лигандом суперсемейства ядерных рецепторов. Легко проникая через клеточную и ядерную мембраны, рецепторы такого типа воздействуют непосредственно на гены, играя роль факторов транскрипции, контролирующих экспрессию генов.

Плейотропные эффекты VD₃ опосредуются, главным образом, через внутриклеточный рецептор витамина D (VDR). VDR является членом надсемейства ядерных стероидов и рецепторов ретиноевой кислоты. Таким образом, он функционирует как лиганд-зависимый фактор транскрипции, регулирующий активацию генов-мишеней витамина D. На молекулярном уровне VDR активизирует свои гены-мишени, взаимодействуя со специфическими последовательностями ДНК, существующими в качестве элементов витамин-D-реагирования (VDR), называемыми "genomicaction" [Hmama Z., Nandan D., Sly L., Knutson K.L., Herrera-Velit P., Reiner N.E. 1999. 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃-induced myeloid cell differentiation is regulated by a vitamin D receptor-phosphatidylinositol 3-kinase signaling complex. J. Exp. Med. V. 190. P. 1583-1594].

В попытках определения молекулярных механизмов регулирования клеточных ответов на VD₃ рассматривалась возможность существования альтернативных путей передачи сигналов к классической программе действия генома. Действительно, в течение последнего десятилетия экспериментальные данные для "негеномной" передачи сигналов имеют концепцию эксклюзивного VDR-опосредованного геномного действия. Например, VD₃ стимулирует быстрое образование вторичных мессенджеров, в том числе керамидов, цАМФ, инозитов, высвобождение катионов кальция и активирует различные протеинкиназы, включая протеинкиназу С, Raf, митоген-активированный белок (МАР-киназу) и Src-семейство киназ. Тем не менее, физиологическое значение негеномной передачи сигналов само по себе или относительно VDR-опосредованного геномного действия до сих пор неясно. Кроме того, не известно, взаимодействует ли VD₃ с классическим VDR для негеномной передачи сигналов или существует система альтернативных рецепторов [Nishizuka Y. Protein kinase С and lipid signaling for sustained cellular responses. FASEB. J. 1995. V. 9. P. 484-496].

Обработка с помощью VD₃ увеличивает поверхностную экспрессию CD11b и CD14 на HL-60, U937 и ТНР-1 клетках [Hmama Z., Nandan D., Sly L., Knutson K.L., Herrera-Velit P., Reiner N.E. 1999. 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃-induced myeloid cell differentiation is regulated by a vitamin D receptor-phosphatidylinositol 3-kinase signaling complex. J. Exp. Med. V. 190. P. 1583-1594].

Из литературных данных известно, что эндотоксины (токсичные липополисахариды) усиливают дифференцирующую активность ряда агентов. Эндотоксин-содержащие бактериальные вакцины проявляют терапевтическую активность у пациентов с острой миебластной лейкемией и узловой бластомой [Kempin S., Cirrincione C., Straus D.S., et al. 1981. Improved Remission Rate and Duration in Nodular Non-Hodgkin's Lymphoma (NNHL) with the Use of Mixed Bacterial Vaccine (MBV). Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. V. 22. P. 514]. Эндотоксины могут вызывать дифференциацию лейкемических клеток in vitro, индуцируя в этих клетках продукцию эндогенных факторов дифференцировки [Falk A., Sachs L. Clonal regulation of the induction of macrophage- and granulocyte-inducing proteins for normal and leukemic myeloid cells. Int. J. Cancer. 1980. V. 26. P. 595-601]. Предполагается, что эндотоксины индуцируют в крови раковых больных наработку GM-DF (дифференцирующий фактор GM), который совместно с соответствующими витаминами дифференцируют лейкозные клетки. Добавление сыворотки этих больных в культуральную среду индуцирует дифференцировку клеток мышей Balb/c с миеломоноцитарной лейкемией WEHI-3 [Moore M.A.S., Gabrilove J., Sheridan A.P. Therapeutic significance of serum factors inhibiting proliferation and inducing differentiation of myeloid leukemic cells. Blood Cells. 1983. V. 9. P. 125-137].

Относительно недавно получены доказательства, что эндотоксины дифференцируют остеокласты. Показано, что следы эндотоксина на титановых частицах ортопедических имплантантов индуцируют у пациентов дифференциацию остеокластов и наработку провоспалительных цитокинов, вызывая усиленное разрушение костной ткани [Yanming В., VanDeMotter R.R., Ragab А.А., Goldberg V.M., Anderson J.M., Greenfield E.M. Titanium Particles Stimulate Bone Resorption by Inducing Differentiation of Murine Osteoclasts. J. Bone Joint. Surg. Am. 2001. V. 83. P. 501-501].

Задача изобретения - физиологическое, практически не токсичное средство для дополнительной дифференцировки моноцитоподобных клеток, дифференцированных 1α,25-дигидроксивитамином D₃.

Поставленная задача решается нетоксичным липополисахаридом из фототрофной бактерии Rhodobacter capsulatus PG.

Данный штамм R. capsulatus PG депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН [Свидетельство о депонировании штамма Rhodobacter capsulatus PG. Регистрационный номер ВКМ В-2381 Д, 21.12.2005].

Ранее известно использование штамма R. capsulatus PG в качестве продуцента липополисахарида, антагониста эндотоксинов [Прохоренко И.Р., Грачев С.В., Зубова С.В. Штамм Rhodobacter capsulatus PG - продуцент липополисахарида, антагониста эндотоксинов. Патент на изобретение RU 2392309 С1, 24.11.2008], а также средства для дифференцировки моноцитоподобных клеток [Прохоренко И.Р., Грачев С.В., Зубова С.В., Кабанов Д.С. Средство для дифференцировки моноцитоподобных клеток. Заявка на изобретение RU 2014138171, 22.09.2014].

Нетоксичный ЛПС R. capsulatus PG исследовался в качестве дополнительного фактора при дифференцировке 1α,25-дигидроксивитамином D₃ клеток моноцитарной линии ТНР-1 в моноциты и макрофаги. Дифференцирующую активность ЛПС исследовали по экспрессии и соотношению поверхностных рецепторов (CD11b и CD14), а также по изменению фагоцитарной способности ТНР-1 клеток.

1. Исследование влияния ЛПС R. capsulatus PG в концентрации 500 нг/мл на изменение уровня и соотношения поверхностных рецепторов (TLR4, CD11b и CD14) ТНР-1 клеток, дифференцированных 1α,25-дигидроксивитамином D₃.

Объектом исследования служила моноцитарная линия клеток ТНР-1 из коллекции ATCC^®TIB™ 202 (США). Клетки ТНР-1 культивировали в среде RPMI 1640 (Sigma), содержащей 2 ммоль/л L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, (L-Glutamin-penicillin-streptomycin solution, Sigma) и 10% инактивированной бычьей сыворотки (Hyclon) во флаконах для культивирования объемом 25 см², 50 мл (Orange Scientific) в СО₂-инкубаторе (Jouan, Франция) при температуре 37°С и 5% CO₂. Жизнеспособность, определяемая по окрашиванию клеток трипановым синим, составляла в среднем 94%.

Для дифференциации ТНР-1 клеток 10⁶ кл/мл в среде RPMI 1640 с добавлением антибиотиков и 10% сыворотки инкубировали с 1α,25-дигидроксивитамином D₃ в концентрации 10^-7 М в течение 72-х часов в CO₂-инкубаторе при температуре 37°С и 5% CO₂. Жизнеспособность, определяемая по окрашиванию клеток трипановым синим, составляла в среднем 92%.

К суспензии клеток ТНР-1, дифференцированных 1α,25-дигидроксивитамином D₃, в среде RPMI 1640 (10⁶ кл/мл) с 10% сывороткой без антибиотиков добавляли водный раствор ЛПС R. capsulatus PG в конечной концентрации 500 нг/мл и инкубировали 24 ч в CO₂-инкубаторе при температуре 37°С и 5% СО₂. Жизнеспособность, определяемая по окрашиванию клеток трипановым синим, составляла в среднем 96%.

В работе использовали антитела к CD14- и CD11b-рецепторам, меченые флуоресцентной меткой: Alexa Fluor 488 anti-human CD14 (Clone HCD14), Alexa Fluor 488 anti-human CD11b (Clone ICRF44) (BioLegend).

После инкубации клеток с ЛПС R. capsulatus PG в конечной концентрации 500 нг/мл в течение 24 ч в CO₂-инкубаторе при температуре 37°C и 5% CO₂, ТНР-1 клетки отделяли от среды культивирования центрифугированием и ресуспендировали в буфере для окрашивания (Cell Staining Buffer, BioLegend) в расчете 10⁵-10⁶ клеток в 100 мкл буфера.

Для исключения неспецифического связывания антител с исследуемыми рецепторами в каждый образец добавляли по 5 мкл блокирующего буфера для Fc-рецепторов (Human Tru Stain FcX™, BioLegend) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем в образцы добавляли по 5 мкл раствора соответствующих антител и инкубировали в течение 30 мин при 4°C. Далее 2 раза отмывали Cell Staining Buffer (по 2 мл), ресуспендировали в 400 мкл этого же буфера и переносили в пробирку для цитофлуориметрии.

Анализ образцов проводили с помощью проточного цитофлуориметра EPICS XL-MCL (Beckman Coulter, США). Уровень поверхностной рецепции ТНР-1 клеток оценивали по величине средней интенсивности флуоресценции (MnIX) образца. В каждом образце просчитывалось 6000 клеток.

Фиг. 1. Изменение уровня CD14 рецептора на поверхности ТНР-1 клеток, дифференцированных 1α,25-дигидроксивитамином D₃, после инкубации с ЛПС R. capsulatus PG, n=7.

Анализ результатов таблицы 1 и фиг. 1 показывает, что ЛПС R. capsulatus PG заметно усиливает экспрессию CD11b- и CD14-рецепторов на поверхности ТНР-1 клеток, предварительно дифференцированных 1α,25-дигидроксивитамином D₃, что свидетельствует о дополнительной дифференцировке ТНР-1 клеток под влиянием ЛПС R. capsulatus PG.

2. Исследование влияния ЛПС R. capsulatus PG в концентрации 500 нг/мл на изменение фагоцитарной активности ТНР-1 клеток, дифференцированных 1α,25-дигидроксивитамином D₃.

Для определения фагоцитарной активности ТНР-1 клеток разной степени дифференцировки использовали BODIPY FL conjugate Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles (Invitrogen), ресуспендированных в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) pH 7,4 (конечная концентрация 20 мг/мл) с добавлением 2 мМ азида натрия и с содержанием клеток 6×10⁹ кл/мл.

Для опсонизации BODIPY FL conjugate Е. coli BioParticles смешивали равные объемы суспензии BioParticles и опсонизирующего реагента (Е. coli BioParticles opsonizing reagent, Invitrogen) и инкубировали при 37°C в течение 1 ч. Проводили отмывку 2-3 раза с помощью ФСБ без азида натрия. Осаждение BioParticles проводили центрифугированием при 800-1500 g в течение 15-20 мин.

К ТНР-1 клеткам (10⁶ кл/100 мл среды RPMI 1640 с 10% сывороткой без антибиотиков) разной степени дифференцировки добавляли по 1 мкл опсонизированных BioParticles (6×10⁶ клеток). Соотношение клетки : бактерии - 1:6. Образцы инкубировали при 37°C в течение 30 мин. Клетки осаждали центрифугированием при 300 g в течение 5 мин при 4°C.

Для гашения внешней флюоресценции в каждый образец добавляли по 100 мкл охлажденного раствора трипанового синего (Trypan blue, Invitrogen, 1 ml, 1,25 mg/ml in citrate-balanced salt solution, pH 4,4) и инкубировали в течение 1 мин при комнатной температуре. Клетки дважды отмывали 2 мл охлажденного Cell Staining Buffer (BioLegend) и осаждали центрифугированием при 300 g в течение 5 мин при 4°C. Осадок ресуспендировали в 400 мкл Cell Staining Buffer.

Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре EPICS XL-MCL (Beckman Coulter, США). Фагоцитарную активность клеток оценивали по средней величине интенсивности флуоресценции (MnI X). Результаты представлены на фиг. 2.

Фиг. 2. Фагоцитарная активность ТНР-1 клеток разной степени дифференцировки, n=9.

Полученные данные показывают, что ЛПС R. capsulatus PG снижает фагоцитарную активность ТНР-1 клеток, дифференцированных 1α,25-дигидроксивитамином D₃, что свидетельствует об изменении направленности дифференцировки ТНР-1 клеток в сторону моноцитов.

На основании полученных результатов по изменению экспрессии CD11b- и CD14-рецепторов на поверхности ТНР-1 клеток, предварительно дифференцированных 1α,25-дигидроксивитамином D₃, под воздействием нетоксичного ЛПС R. capsulatus PG, а также по изменению фагоцитарной активности этих клеток, следует вывод, что нетоксичный ЛПС R. capsulatus PG может выступать в качестве нетоксичного фактора, усиливающего дифференцирующую активность 1α,25-дигидроксивитамина D₃, при дифференцировке моноцитоподобных клеток по моноцитарному типу.

Предложенное свойство может найти применение при создании лекарственных препаратов, в частности, для онкологии.