Способ моделирования тяжелой черепно-мозговой травмы

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к нейрохирургии, и может быть использовано для моделирования на лабораторных животных тяжелой черепно-мозговой травмы с грубыми стойкими нарушениями неврологических и когнитивных функций для мониторинга и разработки способов восстановления функций головного мозга в посттравматическом периоде.

Проблема лечения тяжелой черепно-мозговой травмы (ЧМТ) по-прежнему остается высоко актуальной и социально значимой, так как в большинстве случаев такая травма приводит к инвалидизации, особенно среди лиц молодого возраста. Как известно, степень неврологического и когнитивного дефицита при черепно-мозговой травме определяется двумя основными факторами: первичным механическим повреждением, включающим в себя гибель клеток и некроз тканей независимо от биологических факторов, и вторичным воздействием, связанным с активацией воспаления, ишемией ткани, апоптозом клеток. Эти вторичные поражения представляют собой основную мишень для развития новых терапевтических подходов.

Для изучения механизмов черепно-мозговой травмы и способов восстановления функций головного мозга используются различные модели на животных. Большинство исследований нейробиологии и нейрохимии последствий острой черепно-мозговой травмы основаны на инвазивных способах ее моделирования: трепанации костей черепа животного, травмы коры головного мозга путем ее размозжения или компрессии, например, с помощью жесткого ударника («контролируемое корковое повреждение»), свободного падения груза, жидкостной перкуссии.

Известны способы формирования очагового повреждения головного мозга у лабораторного животного. Наиболее часто применяемые способы - это «жидкостно-перкуссионная травма мозга», модель «контролируемого коркового повреждения» (O'Connor W.T., Smyth A., Gilchrist M.D. (2011). Animal models of traumatic brain injury: a critical evaluation. Pharmacol. Ther. 130, 106-113). Способы воспроизводят выраженное повреждение головного мозга, нейровоспаление и нарушение поведенческих функций, включая когнитивные расстройства.

Однако вышеперечисленные способы имеют сходные недостатки ввиде быстрого спонтанного восстановления функций головного мозга (в течение 2 недель), кроме того, имеются технические сложности в моделировании травмы.

Наиболее близким по техническому выполнению, достигаемому техническому результату и выбранный за прототип предлагаемого изобретения, выбран известный способ моделирования черепно-мозговой травмы, включающий однократное нанесение дозированного механического воздействия на лобно-теменную область (РФ патент №2486602, МПК G09B 23/28, опубл. от 27.06.2013 г).

Известный способ осуществляют следующим образом. Выполняют однократное ударное воздействие на интактную твердую мозговую оболочку через трепанационное окно в лобно-теменно-височной области с энергией удара не менее 0,06 Дж и не более 0,09 Дж.

Известный способ обеспечивает возможность создания контузионного очага в двигательной зоне коры головного мозга животного, позволяющего вызвать стойкий неврологический дефицит, приводит к разрушению нейронов коры головного мозга, формированию грубого глиального рубца и к развитию стойкого и длительного неврологического дефицита.

Однако известный способ имеет высокую степень смертности лабораторных животных, а также быстрое спонтанное восстановление функций мозга (4-5 недель).

Техническим результатом предлагаемого способа является создание условий, максимально воспроизводящих клиническую картину тяжелого очагового повреждения головного мозга без гибели лабораторного животного.

Технический результат достигается тем, что в известном способе моделирования тяжелой черепно-мозговой травмы, включающем однократное нанесение дозированного механического воздействия на лобно-теменную область, ударное воздействие осуществляют на интактную твердую мозговую оболочку через трепанационное окно в лобно-теменной области, путем свободного падения груза массой 4 г с высоты 80 см, при этом диаметр ударной части соответствует диаметру трепанационного окна.

Предлагаемый способ отвечает критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источники научно-технической и патентной информации, которые бы порочили новизну предлагаемого способа, равно как и технических решений с существенными признаками предлагаемого способа.

Технический результат предлагаемого способа заключается в обеспечении создания условий для формирования контузионного очага в сенсомоторной зоне коры головного мозга животного, позволяющего изучать, помимо локальных, травматические изменения, которые сопровождаются вторичной гибелью нервных клеток в отдаленных отделах мозга, чувствительных к травме, таких как гиппокамп, зубчатая извилина, зрительный бугор, а также оценивать грубые двигательные нарушения, изменения тонкой координации движений, дефицит когнитивных функций. Предлагаемый способ позволяет исключить самопроизвольное быстрое восстановление функций (до 5 месяцев), что дает возможность проследить и оценить эффективность терапии, в том числе клеточной, направленной на восстановление функций головного мозга при черепно-мозговой травме. При скорости падения груза массой 4 грамма на заданную область с высоты 80 см в подлежащем мозговом веществе возникают повреждения в виде разрыва твердой мозговой оболочки, образования очагов геморрагического ушиба или размозжения мозгового вещества, характерных для тяжелой черепно-мозговой травмы. Возникающее в данных корковых представительствах тяжелое очаговое повреждение приводит к разрушению нейронов коры головного мозга, формированию грубого глиального рубца и к развитию стойкого и длительного дефицита неврологических и когнитивных функций. Ударное воздействие груза с массой более 4 грамм с высоты более 80 см приводит к гибели животного либо при нанесении травмы, либо в течение 48 часов после нее. При энергии ударного воздействия менее 4 грамм с высоты менее 80 см выраженных когнитивных и неврологических расстройств не наблюдается. В некоторых случаях развивается легкий геми- или монопарез, который разрешается в течение 7 суток.

Черепно-мозговая травма моделировалась в группе из 70-ти 8-10 недельных аутбренных мышей самцов линии C57BL/6 с массой тела 20-22 г.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Наркотизированное животное (1,5% изофлурана) жестко фиксируют в стереотаксической установке для мышей «Narishige» (Япония) для того, чтобы свести к минимуму вариабельность травматического повреждения и последующего нарушения функций из-за произвольных движений животного. Стереотаксическая установка совмещена с установкой для нанесения открытой фокальной черепно-мозговой травмы, которая представляет собой стальную стойку, закрепленную на металлической платформе. К стойке с помощью системы шарниров прикреплены два металлических стержня, расположенные в параллельных плоскостях и служащие для фиксации стерильной полипропиленовой трубы с внутренним диаметром 4 мм. Стерильная полипропиленовая труба закреплена с помощью системы шарниров таким образом, что ее высота и угол относительно нижней платформы и металлической стойки могли меняться. Через данную полипропиленовую трубу сбрасывают груз для нанесения фокального удара по заданной области головы.

Мышь дышит самостоятельно, трахея не интубирована. Хирургическую стадию наркоза определяют по отсутствию у животного роговичного рефлекса. Голову животного прижимают к стальной пластине для предотвращения перелома челюсти и достижения горизонтального расположения свода черепа к торцевому участку груза, а также снижения рассеивания энергии удара. Затем на коже головы, свободной от шерсти и обработанной асептическим раствором, делают срединный продольный разрез (1 см) и производят трепанацию фрезой костей черепа (bregma 2 мм, 2 мм латеральнее от срединной линии). Твердую мозговую оболочку оставляют неповрежденной. Груз, представляющий собой стальной цилиндр весом 4 г, поднимают на высоту 80 см, затем сбрасывают, тем самым нанося удар по области трепанационного окна (диаметр ударной части соответствует трепанационному окну 3 мм). После нанесения травмы кожу животных плотно ушивают хирургической нитью (0,2 мм), шов обрабатывают антисептическим раствором. В течение эксперимента температуру животных поддерживают на уровне 36,5-37,5°С с помощью электрической грелки. После моделирования ЧМТ мышей оставляют для восстановления от наркоза, затем возвращают в жилые клетки. Животным обеспечивают послеоперационный уход и свободный доступ к воде и пище.

Сформировавшиеся когнитивные и неврологические нарушения сохраняются в течение 5 месяцев.

Для объективизации данных и динамики когнитивных нарушений используют тесты распознавания нового объекта (Levy A, Bercovich-Kinori A, Alexandrovich AG, Tsenter J, Trembovler V, Lund FE, Shohami E, Stein R, Mayo L (2009) CD38 facilitates recovery from traumatic brain injury. J Neurotrauma 6 (9): 1521-33; Huang TN, Chuang HC, Chou WH, Chen CY, Wang HF, Chou SJ, Hsueh YP (2014) Tbr1 haploinsufficiency impairs amygdalar axonal projections and results in cognitive abnormality. Nat Neurosci 17 (2): 240-247) и условного рефлекса пассивного избегания (Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М.: Высшая школа, 1991, 400 с.). Для оценки динамики неврологических расстройств очаговый неврологический дефицит оценивают по модифицированной для мышей шкале оценки выраженности неврологического дефицита (Beni-Adani L, Gozes I, Cohen Y, Assaf Y, Steingart RA, Brenneman DE, Eizenberg O, Trembolver V, Shohami E (2001) A peptide derived from activity-dependent neuroprotective protein (ADNP) ameliorates injury response in closedhead injury in mice. J Pharmacol Exp Ther 296 (1): 57-63; Beni-Adani L, Eizenberg O, Cohen Y (2000) Correlation between neurological severity score and T2-weighted MRI in head injured mice. Rest. Neurol. Neurosci 16 (3-4): 242), по которой 7-10 баллов расценивается как выраженное повреждение, 4-6 баллов - умеренное повреждение и 1-3 баллов - как легкое. У всех прооперированных животных наблюдаются грубые когнитивные расстройства, восстановления функций кратковременной и долговременной памяти не происходит ни у одного животного в течение 5 месяцев. Восстановление неврологических функций происходит в два этапа. Первая стадия (8-10 баллов) - грубые неврологические изменения в виде глубокого гемипареза на грани с плегией, нарушение двигательных реакций, невозможность выполнения реакций, связанных с поддержанием равновесия и координации движений, сенсорных задач и рефлекторных навыков, длится до 7 суток. На второй стадии (4-6 баллов) в период с 7 суток до 5 месяцев посттравматического периода происходит частичный регресс грубой неврологической симптоматики ввиде умеренного гемипареза и частичного восстановления сенсорных и рефлекторных навыков.

Пример конкретного выполнения дан в виде протокола эксперимента.

Проведена анестезия животного 1,5% изофлурановым наркозом. Дыхание самостоятельное. По отсутствию у животного роговичного рефлекса определена стадия наркоза. Животное фиксировано в стереотаксической установке для мышей «Narishige» (Япония). Голова животного прижата к стальной пластине для предотвращения перелома челюсти и достижения горизонтального расположения свода черепа к торцевому участку груза, а также снижения рассеивания энергии удара. Затем на коже головы, свободной от шерсти и обработанной асептическим раствором, сделан срединный продольный разрез (1 см) и произведена трепанация фрезой костей черепа (bregma 2 мм, 2 мм латеральнее от срединной линии). Твердая мозговая оболочка не повреждена. Груз (масса 4 г), представляющий собой стальной цилиндр, диаметр ударной части 3 мм, поднят на высоту 80 см, нанесен удар по области трепанационного окна.

Травма нанесена однократно. После нанесения травмы в подлежащем мозговом веществе возникли повреждения в виде разрыва твердой мозговой оболочки, видимое тяжелое очаговое повреждение мозга c прогрессирующим его отеком, образование очагов геморрагического ушиба или размозжения мозгового вещества, характерные для тяжелой черепно-мозговой травмы. Кожа животного плотно ушита хирургической нитью (0,2 мм), шов обработан антисептическим раствором. В течение эксперимента температура животного поддерживается на уровне 36,5-37,5°C с помощью электрической грелки. После моделирования черепно-мозговой травмы мышь оставлена для восстановления от наркоза, затем возвращена в клетку с послеоперационным уходом и свободным доступом к воде и пище.