Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения растительного экстракта из хлорофитума хохлатого

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности способу получения биологически активного экстракта с пребиотическим эффектом из растения хлорофитум хохлатый (Chlorophytum comosum), и может быть использовано в пищевой, химико-фармацевтической, медицинской и биотехнологической промышленности.

Уровень техники

Известен способ использования растения хлорофитум (Chlorophytum borivilianum) для получения фитостеролов и сапонинов, который заключается в предварительной культивации клеток корней растения in vitro в специальной питательной среде, содержащей 0,001-0,2% колхицина, с целью получения полиплоидных клеток, последующей их лиофилизации, приготовлении спиртового экстракта и его фильтрации (см. патент на изобретение WO 2015102018 А1).

Недостатком этого способа является сложный технологический процесс, а также неизвестно его пребиотическое действие.

Известен способ применения растения хлорофитум (Chlorophytum laxum) для приготовления лечебных таблеток, который заключается в том, что травянистую часть растения пропитывают спиртом, нагревают и возгоняют дважды, затем фильтруют и концентрируют при повышенном давлении при температуре ниже плюс 80°C, сушат, измельчают и просеивают, добавляют крахмал, этанол используют как смешивающий агент, образовавшиеся гранулы просеивают, добавляют тальк и стеарат магния, формируют таблетки под прессом (см. патент на изобретение CN 1965992 А).

Недостатком этого способа является сложный технологический процесс, не до конца раскрытый потенциал сырья, а также неизвестно его пребиотическое действие.

Известен способ применения растения хлорофитум (Chlorophytum borivilianum) для изготовления фармацевтической композиции, который заключается в том, что сок растения или его экстракт смешивают с сахарозой, ароматизатором и сорбатом, растворяют в 200 мл воды, доводят рН раствора до значения 3.0-3.5 с помощью лимонной кислоты с последующим добавлением ксантановой камеди, перемешивают, фильтруют и нагревают раствор до плюс 80°C (см. патент на изобретение WO 2008020451 A2).

Недостатком этого способа является сложный технологический процесс, а также неизвестно его пребиотическое действие.

Известен способ использования растений рода Chlorophytum для приготовления композиции для борьбы с ожирением и восстановления здоровья, который заключается в том, что водный, спиртовой или приготовленный любым известным способом экстракт корней Chlorophytum соединяют с сопутствующими компонентами, придают любую необходимую фармацевтическую форму (таблетки, сироп, эликсир или капсулы) и применяют в соответствующих дозах в медицинских целях (см. патент на изобретение СА 2580926 А1).

Недостатком этого способа является недостаточное раскрытие технологической сущности, отсутствие пребиотического эффекта

Наиболее близким по технической сущности и принятым авторами за прототип, является способ использования растения Chlorophytum borivilianum для получения фармацевтической композиции с иммуномодулирующим действием, который заключается в том, что высушенные клубни растения экстрагируют двадцатью объемами воды (20 мл на г сухой массы) при комнатной температуре в течение 12 ч при постоянном перемешивании и фильтруют. Затем остаток повторно экстрагируют по описанному выше принципу. Два фильтрата соединяют вместе, добавляют этанол до насыщения 80%, содержимое тщательно перемешивают и выдерживают в течение 6 ч при комнатной температуре. Осажденный полисахарид извлекают, растворяют в воде и фильтруют. Фильтрат представляет собой водный экстракт водорастворимой полисахаридной фракции неочищенного полисахарида. Затем его дополнительно очищают путем обработки 6% трихлоруксусной кислотой, осадок центрифугируют и отбрасывают. Супернатант осаждают этанолом, чтобы восстановить легко солюбилизируемый полисахарид (см. патент на изобретение WO 2007113646 А2).

Недостатком данного способа является не выявленное пребиотическое действие конечного продукта.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения экстракта из растения хлорофитум хохлатый (Chlorophytum comosum), а также расширение ассортимента пребиотических средств, получаемых в виде экстракта из растительного сырья, обладающих биологической активностью.

Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого способа, сводится к получению дешевого и эффективного биологически активного экстракта из легкодоступного сырья растения Хлорофитум хохлатый, применение которого приводит к избирательной стимуляции роста и развитию нормальной микрофлоры кишечника, в результате чего оказывается благоприятное воздействие на организм в целом.

Технический результат достигается с помощью способа получения экстракта из листьев хлорофитума хохлатого (Chlorophytum comosum), включающего их непрерывное промывание под проточной водой в течение 5…10 минут, помещение в холодильную камеру при температуре плюс 4… плюс 6°C на 4…5 суток, измельчение до размеров 0,5…2 см, помещение в морозильную камеру при температуре минус 38… минус 40°C на 48…50 часов, сублимационную сушку при рабочем давлении в сублиматоре 70…80 Па, температуре конденсора минус 45… минус 50°C и общей длительности цикла сушки 30-35 часов. Проводят экстракцию: лиофилизированные листья заливают 70% этиловым спиртом в соотношении 1:25, помещают в термостат-шейкер при температуре плюс 70… плюс 72°C и скорости перемешивания 125…130 оборотов в минуту на 1…1,5 часа, затем извлекают из термостата и оставляют при комнатной температуре на 24…26 часа. Первый экстракт процеживают. Далее экстракцию обработанного сырья повторяют дважды аналогично экстракции, описанной выше. Три полученных экстракта объединяют, концентрируют на роторном испарителе при температуре бани плюс 50… плюс 52°C и вакууме 7 мбар до момента полного удаления спирта. Концентрированный экстракт автоклавируют при температуре плюс 121°C в течение 10…15 мин.

Таким образом, технический результат достигается за счет оптимальных параметров приготовления экстракта, позволяющих перенести в конечный продукт как можно больше биологически активных веществ из исходного растительного сырья.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения способа получения экстракта из наземной части хлорофитума хохлатого.

Пример 1

Сырье для экстракта предварительно обрабатывается следующим образом: листья хлорофитума хохлатого промываются под проточной водой в течение 5…10 минут, помещаются в холодильную камеру при температуре плюс 4… плюс 6°C на 4…5 суток, измельчаются до размеров 0,5…2 см, помещаются в морозильную камеру при температуре минус 38… минус 40°C на 48…50 часов, проходят сублимационную сушку при рабочем давлении в сублиматоре 70…80 Па, температуре конденсора минус 45… минус 50°C и общей длительности цикла сушки 30-35 часов.

Лиофилизированные листья хлорофитума хохлатого заливают 50% этиловым спиртом в соотношении 1:25, помещают в термостат-шейкер при температуре плюс 70… плюс 72°C и скорости перемешивания 125…130 оборотов в минуту на 1…1,5 часа, затем извлекают из термостата и оставляют при комнатной температуре на 24…26 часа. Первый экстракт процеживают. Далее экстракцию обработанного сырья повторяют дважды аналогично экстракции, описанной выше. Три полученных экстракта объединяют и концентрируют на роторном испарителе при температуре бани плюс 50… плюс 52°C и вакууме 7 мбар до момента полного удаления спирта. Концентрированный экстракт автоклавируют при температуре плюс 121°C в течение 10…15 мин.

В конечном экстракте спектрофотометрическим методом измеряли концентрацию флавоноидов, так как они являются биологически активными и основными действующими веществами растительных экстрактов. Итоговая концентрация составила 8,6 мг на 100 мл экстракта.

Пример 2

Сырье для экстракта предварительно обрабатывается следующим образом: листья хлорофитума хохлатого промываются под проточной водой в течение 5…10 минут, помещаются в холодильную камеру при температуре плюс 4… плюс 6°C на 4…5 суток, измельчаются до размеров 0,5…2 см, помещаются в морозильную камеру при температуре минус 38… минус 40°C на 48…50 часов, проходят сублимационную сушку при рабочем давлении в сублиматоре 70…80 Па, температуре конденсора минус 45… минус 50°C и общей длительности цикла сушки 30-35 часов.

Лиофилизированные листья хлорофитума хохлатого заливают 50% этиловым спиртом в соотношении 1:15, помещают в термостат-шейкер при температуре плюс 70… плюс 72°C и скорости перемешивания 125…130 оборотов в минуту на 1…1,5 часа, затем извлекают из термостата и оставляют при комнатной температуре на 24…26 часа. Первый экстракт процеживают. Далее экстракцию обработанного сырья повторяют дважды аналогично экстракции, описанной выше. Три полученных экстракта объединяют и концентрируют на роторном испарителе при температуре бани плюс 50… плюс 52°C и вакууме 7 мбар до момента полного удаления спирта. Концентрированный экстракт автоклавируют при температуре плюс 121°C в течение 10…15 мин.

В конечном экстракте спектрофотометрическим методом измеряли концентрацию флавоноидов, так как они являются биологически активными и основными действующими веществами растительных экстрактов. Итоговая концентрация флавоноидов составила 8,5 мг на 100 мл экстракта.

Пример 3

Сырье для экстракта предварительно обрабатывается следующим образом: листья хлорофитума хохлатого промываются под проточной водой в течение 5…10 минут, помещаются в холодильную камеру при температуре плюс 4… плюс 6°C на 4…5 суток, измельчаются до размеров 0,5…2 см, помещаются в морозильную камеру при температуре минус 38… минус 40°C на 48…50 часов, проходят сублимационную сушку при рабочем давлении в сублиматоре 70…80 Па, температуре конденсора минус 45… минус 50°C и общей длительности цикла сушки 30-35 часов.

Лиофилизированные листья хлорофитума хохлатого заливают 70% этиловым спиртом в соотношении 1:25, помещают в термостат-шейкер при температуре плюс 70… плюс 72°C и скорости перемешивания 125…130 оборотов в минуту на 1…1,5 часа, затем извлекают из термостата и оставляют при комнатной температуре на 24…26 часа. Первый экстракт процеживают. Далее экстракцию обработанного сырья повторяют дважды аналогично экстракции, описанной выше. Три полученных экстракта объединяют и на роторном испарителе при температуре бани плюс 50… плюс 52°C и вакууме 7 мбар до момента полного удаления спирта. Концентрированный экстракт автоклавируют при температуре плюс 121°C в течение 10…15 мин.

В конечном экстракте спектрофотометрическим методом измеряли концентрацию флавоноидов, так как они являются биологически активными и основными действующими веществами растительных экстрактов. Итоговая концентрация флавоноидов составила 12,4 мг на 100 мл экстракта.

Пример 4

Сырье для экстракта предварительно обрабатывается следующим образом: листья хлорофитума хохлатого промываются под проточной водой в течение 5…10 минут, помещаются в холодильную камеру при температуре плюс 4… плюс 6°C на 4…5 суток, измельчаются до размеров 0,5…2 см, помещаются в морозильную камеру при температуре минус 38… минус 40°C на 48…50 часов, проходят сублимационную сушку при рабочем давлении в сублиматоре 70…80 Па, температуре конденсора минус 45… минус 50°C и общей длительности цикла сушки 30-35 часов.

Лиофилизированные листья хлорофитума хохлатого заливают 70% этиловым спиртом в соотношении 1:15, помещают в термостат-шейкер при температуре плюс 70… плюс 72°C и скорости перемешивания 125…130 оборотов в минуту на 1…1,5 часа, затем извлекают из термостата и оставляют при комнатной температуре на 24…26 часа. Первый экстракт процеживают. Далее экстракцию обработанного сырья повторяют дважды аналогично экстракции, описанной выше. Три полученных экстракта объединяют и концентрируют на роторном испарителе при температуре бани плюс 50… плюс 52°C и вакууме 7 мбар до момента полного удаления спирта. Концентрированный экстракт автоклавируют при температуре плюс 121°C в течение 10…15 мин.

В конечном экстракте спектрофотометрическим методом измеряли концентрацию флавоноидов, так как они являются биологически активными и основными действующими веществами растительных экстрактов. Итоговая концентрация флавоноидов составила 10,9 мг на 100 мл экстракта.

Таким образом, наиболее оптимальным по нашему мнению является способ получения экстракта из хлорофитума хохлатого (Chlorophytum comosum) по примеру 3, так как именно этот метод обеспечивает наибольший выход основных действующих веществ при одинаковом исходном количестве сырья.

Затем были проведены испытания влияния на организм теплокровных животных экстракта из хлорофитума хохлатого (Chlorophytum comosum), полученного по примеру 3. Для этого производили исследование состава микрофлоры кишечника белых крыс при экспериментальном антибиотико-ассоциированном дисбактериозе.

Все эксперименты на животных были выполнены согласно Директиве ЕС 86/609/ЕЕС и в соответствии с законодательством Российской Федерации, регулирующим проведение экспериментов на животных.

Исследование было проведено на 60 самцах белых крыс линии Вистар в возрасте 9 месяцев, со средней массой тела 250 г, которые были рандомизированы и разделены на 2 группы, контрольную и опытную, по 30 особей в каждой. Животные содержались в виварии в стандартных условиях, со свободным доступом к воде и корму. Температура воздуха в помещении составляла плюс 20… плюс 22°C, влажность воздуха 40-45%, цикл освещения 12:12.

Материалом для бактериологического исследования послужили фекалии крыс. Сбор фекалий производили в стерильную, герметически закрывающуюся посуду стерильным шпателем. Время от момента взятия материала до его обработки в лаборатории не превышало 5 часов. Для проведения бактериологического анализа кала использовали отраслевой стандарт по дисбактериозу кишечника.

На начальном этапе эксперимента у всех животных, вошедших в опытную и контрольную группы, было проведено фоновое бактериологическое исследование содержимого толстого кишечника. После чего у них инициировали развитие нарушений микробиоценоза путем перорального введения им гентамицина сульфата шприцем посредством иглы с оливой на конце в дозах 10 мг 2 раза в сутки в пересчете на вес тела исходя из среднесуточных доз антибиотика для людей в течение 10-ти дней. Животные контрольной группы при этом получали стандартный рацион, рекомендуемый НИИ питания РАМН, а животным опытной группы каждый день на протяжении эксперимента в дополнение к нему выпаивалось по 0,5 мл экстракта, полученного по примеру 3 из хлорофитума хохлатого (Chlorophytum comosum) на крысу с учетом переводного коэффициента для крыс.

Следующий отбор фекалий для проведения бактериологического исследования у подопытных животных производили на 5-й день и 10-й день.

Подсчитывали количество Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp, Escherichia coli с нормальной ферментативной активностью, Candida spp. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Результаты, представленные в таблице 1, показывают, что у животных обеих групп, находящихся в состоянии антибиотико-ассоциированного дисбактериоза на стандартном питании, уже на 5-е сутки наблюдается достоверное снижение количества Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp, Escherichia coli, которое продолжается вплоть до окончания эксперимента. Количество Candida spp. у животных контрольной группы на фоне антибиотико-ассоциированного дисбактериоза, напротив, достоверно увеличивается начиная с 5-го дня вплоть до окончания эксперимента, в то время как у животных, получавших экстракт из хлорофитума хохлатого (Chlorophytum comosum), достоверное увеличение количества Candida spp. зафиксировано лишь на 10-й день. Таким образом, применение экстракта из хлорофитума хохлатого (Chlorophytum comosum) позволило задержать увеличение количества грибов Candida spp. в организме крыс на фоне антибиотико-ассоциированного дисбактериоза.

Патогенные микроорганизмы и микроорганизмы рода Proteus, Klebsiella, Citrobacter, гемолизирующая флора у всех экспериментальных крыс до начала и после окончания эксперимента нами не были обнаружены.

После прекращения перорального введения гентамицина животные контрольной группы были разделены на 2 подгруппы по 15 крыс в каждой. Животные первой подгруппы (контрольной) в течение следующих 7-ми дней получали стандартный рацион, рекомендуемый НИИ питания РАМН, а животным второй подгруппы (опытной) каждый день на протяжении эксперимента в дополнение к нему выпаивали 0,5 мл экстракта из хлорофитума хохлатого (Chlorophytum comosum) на крысу с учетом переводного коэффициента на единицу поверхности тела. Отбор фекалий для проведения бактериологического исследования у животных обеих подгрупп производили на 3-й и 7-й день (по окончании эксперимента).

Подсчитывали количество Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp, Escherichia coli, Candida spp. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что после прекращения введения гентамицина у животных 1-й подгруппы (контрольной), находящихся на стандартном питании, снижение количества Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp, Escherichia coli и повышение количества Candida spp. продолжается вплоть до 3-х суток. По окончании эксперимента на 7-е сутки зафиксировано достоверное увеличение количества Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp, что свидетельствует о медленном самовосстановлении микрофлоры.

Животные второй подгруппы (опытной), получавшие экстракт из хлорофитума хохлатого (Chlorophytum comosum), демонстрировали снижение Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp, вплоть до 3-х суток, а затем их медленное возрастание, как и животные первой подгруппы, однако на 3-и сутки эксперимента у них происходит достоверное увеличение количества Escherichia coli с нормальными ферментативными свойствами, которое продолжается до 7-х суток. Также в этой подгруппе наблюдается снижение количества Candida spp. по сравнению с первой подгруппой животных.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что экстракт из хлорофитума хохлатого (Chlorophytum comosum), полученный предложенным способом, благоприятно влияет на показатели кишечной микрофлоры теплокровных животных, что, в частности, выражается в увеличении количества представителей Escherichia coli с нормальными ферментативными свойствами и сдерживании роста грибов рода Candida spp.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- экстракт из хлорофитума хохлатого (Chlorophytum comosum), полученный с помощью предлагаемого изобретения, обладает пребиотическим действием на организм, способствует стимуляции роста и развития нормальной микрофлоры кишечника, в результате чего оказывается благоприятное воздействие на организм в целом;

- основные методики, препараты, аппараты, используемые в приготовлении препарата, легко доступны;

- продукт, полученный с помощью предложенного способа, имеет низкую себестоимость, т.к. в его производстве используется легкодоступное растительное сырье;

- экологическая чистота, отсутствие вредных примесей.

Литература

1. Патент WO 2015102018 A1. Process of enhancement of stigmasterol and hecogenin content in in vitro root cultures of chlorophytum borivilianum through polyploidy / Bathoju Gayathri. Опубл. 09.07.2015.

2. Патент CN 1965992 А. Use of Chlorophytum laxum R, Br and method for preparing the formulation thereof / Meiquan Xi, Zhong Xiwen, Kong Xianglian. Опубл. 23.05.07.

3. Патент WO 2008020451 A2. Nutraceutical compositions and methods of use of safed musli extracts / Jayakumar Bhavanasi, Swati Kamlesh Kshirsagar, Gopinathan Sinnathurai. Опубл. 21.02.2008.

4. Патент СА 2580926 Al. Compositions for anti-obesity, health-restorative and health-promotional benefits / Shibnath Ghosal. Опубл. 06.04.2006.

5. Патент WO 2007113646 А2. A pharmaceutical composition useful as an immunomodulating agent and a process for the preparation thereof / Rajender Singh Sangwan, Narayan Das Chaurasiya, Laxmi Narain Misra, Payare Lal, Girish Chandra Uniyal, Neelam Singh Sangwan, Avdhesh Kumar Srivastava, Krishan Avtar Suri, Ghulam Nabi Qazi, Rakesh Tuli. Опубл. 11.10.2007.