Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогнозирования послеродового эндометрита с помощью показателя детоксикационной эффективности альбумина

1. Область техники

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, гинекологии, иммунологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для оптимизации прогнозирования послеродового эндометрита, основываясь на определении состояния системного иммунитета.

2. Уровень техники

В последние годы возрастает роль различных лабораторных методов в предикции и диагностике послеродового эндометрита, однако до сих пор методов точного прогнозирования его развития не существует. Клинико-лабораторные признаки системной воспалительной реакции (лихорадка, тахикардия, лейкоцитоз и другие изменения в гемограмме и гемостазиограмме) и ее маркеры (концентрация эндотоксина и цитокинов, прокальцитонина) не являются надежными критериями предикции и ранней диагностики.

Диагностика послеродовых инфекционных заболеваний основывается на клинической картине, данных лабораторного и инструментального исследований. Благодаря уникальности физиологического состояния после родов, предикция и диагностика послеродовой инфекции становится зачастую довольно трудной задачей.

Развернутый (с лейкоцитарной формулой) клинический анализ крови - это самый доступный и рутинный метод диагностики воспалительного процесса, хотя нет никаких твердых доказательств клинической роли и диагностической надежности лейкоцитоза в подтверждении послеродовой инфекции. Так, по данным авторов U.P. Dior, L. Kogan (2014 г.), между лейкоцитозом, невыраженной нейтрофилией и бактериальной инфекцией не найдена статистическая зависимость, что поставило их значение в назначении антибактериальной терапии под сомнение.

К наиболее изученным и применяемым в клинической практике маркерам послеродовой инфекции относятся: C-реактивный белок (СРБ), ПКТ (прокальцитонин). «Золотым стандартом» в диагностике воспалительных осложнений считается СРБ или белок острой фазы. Как известно, увеличение СРБ в сыворотке является маркером развития субклинической инфекции во время беременности в различных ситуациях, включая преждевременные роды и преждевременный разрыв плодных оболочек и осложнений, возникающих в процессе послеродового периода, таких как тромбофлебит, тромбоэмболии или эндометрит. Однако, по данным исследований De Meeus, J.B. Pourrat, О. Gombert и J. Magnin (2008 г.), уровень СРБ намного превосходит норму во время родов и увеличивается многократно в послеродовом периоде: СРБ был значительно увеличен в период наступления родов (4,10+/-2,79 мг/л) и достигал очень высокого уровня в послеродовом периоде (24,07+/-18,28 мг/л) по сравнению со стандартной нормальной сывороткой в популяции у небеременных женщин того же возраста (2,39+/-0,07 мг/л). Существенным является тот факт, что повышение СРБ обнаруживается лишь через 12 часов после манифестации клинических признаков воспалительного процесса, в связи с чем использование его как предиктора становится нецелесообразно.

В 2005 году тест на прокальцитонин (ПКТ) одобрен управлением по контролю над пищевыми продуктами и лекарственными препаратами США (Food and Drug Administration - FDA) и рекомендован к широкому клиническому применению. Повышение концентрации ПКТ происходит при системном воспалении бактериальной этиологии, которое имеет место, в частности, при тяжелых бактериальных инфекциях и сепсисе. ПКТ достигает пиковых значений раньше, чем СРБ. В то же время считается, что изменение его уровней необязательно отражает наличие инфекции и реальную динамику течения воспалительного процесса, особенно при нестабильности гемодинамики. Paccolat С. с соавторами в 2011 году представили нормативные значения ПКТ в различные сроки послеродового периода: на 2-3 день: 0,200 мкг/л (диапазон 0,030-5,00); на 10 день: 0,060 мкг/л (диапазон 0,020-0,120). Уровень ПКТ более 0,25 мкг/л может быть использован для исключения инфекции. ИЛ-6 после начала инфекции повышается относительно быстро, но через 24 часа снижается до неопределенного уровня и является весьма малоинформативным методом.

Использование традиционных критериев диагностики бактериальных инфекций является в ряде случаев недостаточным, что обусловливает необходимость поиска биохимических маркеров, которые позволяют максимально рано диагностировать, определять тяжесть, оценивать течение и прогнозировать исход при тяжелых инфекциях.

Многие исследователи в последнее время придают большое значение в развитии инфекционной патологии альбумину. Обычно отмечается снижение уровня этого транспортного белка в крови при тяжелой инфекции. В случае развития в организме патологических процессов, в частности послеоперационных инфекционных осложнений, в сыворотке крови появляются специфические белки, влияющие на структуру альбуминов. Изменения структуры обуславливает нарушение транспортной и детоксикационной эффективности альбуминов (DTE) (Lowenthal et al., 2005). Доказано, что изменение связывающей способности белков имеет прогностическое значение при развитии инфекционно-воспалительных осложнений, в частности снижается уровень альбумина в крови при тяжелой септической инфекции.

3. Реализация изобретения

3.1. Взятие и обработка материала

Образцы крови (плазма, сыворотка) взяты у всех женщин на 3 сутки послеродового периода. В каждой группе определялись уровни лейкоцитов, C-реактивного белка (СРБ), показателя детоксикационной эффективности альбумина (DTE). Кровь забирали из вены в пробирку без консерванта в объеме 5 мл. Для анализа достаточно 0,7 мл сыворотки крови. Кровь отстаивалась не менее 15 минут. Сыворотку получали центрифугированием при 3000 мин^-1 в течение 10 минут. Пробирки промаркированы водостойким маркером или наклейками. В случае необходимости допускалась быстрая заморозка проб сыворотки. Оптимальная температура хранения минус 30°C. Повторная заморозка-разморозка проб не допускалась.

Метод заключается в регистрации спектров ЭПР сыворотки крови, в которую добавляется свободно радикальное соединение - спиновая метка (16-доксил стеариновая кислота). В результате специфического связывания метки белками сыворотки крови происходит их фиксация, и спиновая метка приобретает ограниченную подвижность, изменяется ее ЭПР-спектр.

Специфика изменений альбуминов сыворотки крови под влиянием метаболических сдвигов в организме обуславливает изменение их способности фиксировать спиновую метку.

Специальное программное обеспечение анализатора «ЭПР АХМ-09» для проведения АТА-теста позволяет оценивать спектр с помощью многокомпонентных математических моделей. При сравнении ЭПР-спектров оценивается емкость центров связывания жирных кислот, полярность окружения молекул зонда в сайтах, их подвижность и константы связывания и диссоциации на всех стадиях транспорта.

Для проведения АТА-теста использовался анализатор лабораторный электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР АХМ-09, регистрационное удостоверение Росздравнадзора № ФСЗ 2012/12247 от 01.07.12 г.) и наборы реагентов (АТА-тест Т-20), регистрационное удостоверение Росздравнадзора № РАН 2013/377 от 15.03.13 г.).

Статистический анализ полученных результатов проведен на персональном компьютере при помощи электронных таблиц Microsoft Office Exel 2010, и пакета прикладных программ «Statistica» v. 13.0 StatSoft Inc. (США) и SPSS 22 (IBM).

Различия считались значимыми в случае, если уровень значимости составил p<0,05.

Для оценки прогностической способности модели использовали ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic - операционная характеристика приемника) и бинарную логистическую регрессию. Основой ROC-анализа является построение ROC-кривой, которая используется для предоставления результатов бинарной классификации в машинном обучение. ROC-кривая отражает зависимость количества верно классифицированных положительных примеров от количества неверно классифицированных отрицательных примеров. Судить о качестве модели можно по значению AUC (Area Under Curve - площадь под кривой).

3.2 Описание изобретения

В исследовании проведено 2 этапа: на первом этапе проводился сплошной забор образцов крови у 267 женщин на 3 сутки после родов, из них у 16 в последующем развился эндометрит. Проанализированы значения DTE в группе женщин развивших эндометрит в сравнении с группой женщин с нормальным течением послеродового периода. Оценивалось их значение в плане предикции послеродовых осложнений.

На втором этапе работы изучена диагностическая значимость этих маркеров при развитии эндометрита.

Основную группу (Iа) составили 58 пациенток с развитием в послеродовом периоде эндометрита. Группу сравнения (Iб) составили 251 родильница с неосложненным течением послеродового периода. Каждая группа подразделена на подгруппы в зависимости от родоразрешения: IIа1 и IIб1 - после самопроизвольных родов и IIа2 и IIб2 - после кесарева сечения. Группы были сопоставимы по исходной клинической характеристике.

Во всех группах определялись уровни лейкоцитов в крови, C-реактивного белка (СРБ), показателя детоксикационной эффективности альбумина (DTE).

В работе изучалась прогностическая и диагностическая ценность определения показателя детоксикационной эффективности альбумина (DTE) в предикции и диагностике ПЭ.

С целью определения прогностической ценности DTE изучены показатели, полученные на 1 и 3 сутки послеродового периода у 1015 пациенток. В дальнейшем, прослежено течение послеродового периода у данных пациенток. В зависимости от развития эндометрита проведена рандомизация женщин на группы и исследованы изучаемые параметры. Для определения диагностического значения указанных маркеров сбор анализов осуществлялся в начале заболевания при появлении его первых признаков. Выявлено, что при нормальном течении послеродового процесса показатели DTE в динамике достоверно увеличиваются: Iб1 (на 1 сутки - 62,32±21,63% и на 3 сутки - 66,43±14,31%) и Iб2 (на 1 сутки - 49,12±22,54% и на 3 сутки - 54,75±15,97%) (p<0,05). При развитии воспалительного процесса, наоборот, достоверно снижаются: Ia1 (на 1 сутки - 61,95±1,77% и на 3 сутки - 44,04±6,40%) и Iа2 (на 1 сутки - 49,59±18,66 и на 3 сутки - 36,15±6,21) (p<0,05) (фиг. 1).

Таким образом, у женщин с высоким риском развития эндометрита с целью его прогнозирования можно использовать данный показатель.

Из исследуемых параметров отмечалось достоверное снижение DTE (p<0,05) у женщин Iа группы в сравнении с показателями у женщин Iб группы. У женщин Iа группы выявлена достоверная тенденция к увеличению лейкоцитов (p<0,05), но недостоверное снижение СРБ (p<0,05). В связи с чем, данный маркер (DTE) можно оценить как значимый предиктор развития ПЭ. С целью диагностики ПЭ изучены изменения тех же маркеров (таблица 2).

Среди показателей, представленных в таблице 2, видно, что достоверно значимые отличия отмечались при исследовании DTE, уровня лейкоцитов (p<0,05).

Согласно исследованиям В.А. Муравского с соавторами, показатели DTE при развитии воспалительного процесса снижаются менее 40% (в норме 40-175%). Как видно из результатов, представленных в таблице 2, отмечается статистически достоверное увеличение уровня лейкоцитов и снижение DTE при развитии эндометрита. С целью изучения диагностической значимости указанных параметров у родильниц с развитием эндометрита в послеродовом периоде проведен ROC анализ чувствительности и специфичности исследованных показателей для определения ПЭ. При проведении ROC-анализа показано, что высокой диагностической ценностью обладает DTE, чувствительность и специфичность которого составила: 69,7% и 81,8% (AUC=0,756, cut-off=40%) по сравнению с остальными показателями (фиг. 2-3). Показатель СРБ по чувствительности составил 78,6% и специфичности - 61,9% (AUC=0,702, cut off=41,97 мг/л), что может быть расценено как значимое.

В результате можно сделать вывод о высокой диагностической ценности указанного маркера при развитии воспалительного процесса. Таким образом, использование показателя DTE в рутинной практике может улучшить прогноз и диагностику послеродового эндометрита.

3.3. Пример использования изобретения

Пример 1. Пациентка Д., 22 лет: 1 своевременные оперативные роды. В анамнезе - бактериальный вагинит. Оперирована в экстренном порядке в связи с упорной слабостью родовой деятельности. Продолжительность родов 15 часов.

По данным клинико-лабораторных параметров, риск развития ПЭ был высоким в связи с наличием факторов риска: проведение экстренной операции, длительный безводный промежуток (13,8 часов) и продолжительность родов 15 часов.

На 3 сутки был произведен забор плазмы крови, определен уровень показателя детоксикационной эффективности альбумина (DTE) - 38%. На 4 сутки впервые проявились признаки ПЭ: гипертермия (температура тела выше 38°C), болевой синдром, изменение характера лохий (появление неприятного ихорозного запаха и мутный цвет), а также симптомы интоксикации (слабость, апатия, отсутствие аппетита). По данным клинико-лабораторного обследования: лейкоцитоз - 19,26×10⁹/л и нейтрофильный сдвиг (нейтрофилы 88,4%), уровень C-реактивного белка - 50,8 мг/л. Начато проведение антибактериальной терапии (амоксициллин/клавулановая кислота 1,2 г × 3 р/д в/в и метронидазол 100 мл × 3 р/д в/в), инфузионной и симптоматической терапии. На фоне проводимой терапии состояние пациентки улучшилось. При проведении контрольного клинико-лабораторного обследования на фоне клинического улучшения: показатель детоксикационной эффективности альбумина (DTE) - 73%. Пациентка выписана в удовлетворительном состоянии.

Представленный клинический пример показывает, что у пациентки выраженное снижение DTE прогнозировало развитие эндометрита еще до развития клинических признаков, что способствовало своевременной диагностике и началу лечения.

Пример 2.

Пациентка Л., 28 лет: 1 своевременные оперативные роды. Течение данной беременности протекало на фоне истмико-цервикальной недостаточности и наложением швов на шейку матки, угрозы прерывания.

По данным клинико-лабораторных параметров, риск развития ПЭ был высоким в связи с наличием факторов риска: проведение экстренной операции в связи с преждевременным излитием околоплодных вод и незрелостью родовых путей при тазовом предлежании плода. Длительность операции составила 61 минуту.

На 5 сутки начали проявляться признаки воспалительного процесса: гипертермия однократно (температура тела 38°C) при удовлетворительном самочувствии и других проявлений ПЭ. По данным клинико-лабораторного обследования: лейкоцитоз - 13,22×10⁹/л и нейтрофильный сдвиг (нейтрофилы 80,9%), уровень C-реактивного белка - 10,5 мг/л. При проявлении признаков воспаления взяты изучаемые маркеры: показатель детоксикационной эффективности альбумина (DTE) - 32,5%. Начато проведение антибактериальной терапии (амоксициллин/клавулановая кислота 1,2 г × 3 р/д в/в), инфузионной и симптоматической терапии. На 2 сутки от начала антибиотикотерапии при отсутствии клинического улучшения состояния произведен контрольный забор плазмы крови: показатель детоксикационной эффективности альбумина (DTE) - 29%. Произошла замена антибактериальных препаратов в связи с их неэффективностью на имипенем/циластатин. На фоне проводимой терапии состояние пациентки улучшилось. При проведении контрольного клинико-лабораторного обследования на фоне клинического улучшения: показатель детоксикационной эффективности альбумина (DTE) - 54%. Пациентка выписана в удовлетворительном состоянии.

Представленный клинический пример показывает, что принятие во внимание низкого уровня показателя детоксикационной эффективности альбумина (DTE) при ПЭ позволило своевременно изменить схему антибактериальной терапии и получить положительный эффект.

Источники информации

1. Андреева О.Л. Изменение связывающих центров сывороточного альбумина в оценке состояния организма при различных патологиях // диссертация. 2003. Екатеринбург.

2. Белокриницкая Т.Е. Состояние защитных систем и их коррекция при эндометритах после родов и кесарева сечения / Т.Е. Белокриницкая, Ю.А. Витковский. - Чита: Поиск, 1999. 103 с.

3. Касабулатов Н.М. Послеродовой эндометрит: патогенез, особенности клеточного и гуморального иммунитета, диагностика и лечение // диссертация. Москва, 2006 г.

4. Краснопольский В.И. Инфекция в акушерстве: сборник научных трудов / B.И. Краснопольский, Л.С. Мареева. М., 1994. - 112 с.

5. Машевский А.А., Муравский В.А. «Алгоритмы определения параметров биомолекул для создания диагностических медицинских методик на основе метода спиновых зондов ЭПР. Актуальные проблемы онкологии и медицинской радиологии» / Сб. научн. работ НИИ ОМР МЗ РБ. Минск, 1993. C. 31-33.

6. Мешалкина И.В. Плазмоферез в комплексной терапии послеродового эндометрита // диссертация. 2010 г. Москва.

7. Селихова М.С. Прогнозирование течения послеродового периода / Селихова М.С., Смольянинова С.В., и др. // Тезисы 3-й межобластная научно-практическая конференция - Саратов, 1997 - С 9596.

8. Aflatoonian R., Fazeli A. Toll-like receptors in female reproductive tract and their menstrual cycle dependent expression. J Reprod Immunol 2008; 77:7-13.

9. De Meeus J.B., Pourrat O., Gombert J., Magnin G. C-reactive protein levels at the onset of labour and at day 3 post-partum in normal pregnancy. Clin Exp Obstet Gynecol. 1998; 25(1-2):9-11.

10. Dior U.P., Kogan L. et al. Leukocyte blood count during early puerperium and its relation to puerperal infection. J. Matern Fetal Neonatal Med. 2014 Jan; 27(1):18-23.

11. Enguix-Armada A., Escobar-Conesa R., La Torre A.G, De La Torre-Prados M.V. Usefulness of several biomarkers in the management of septic patients: C-reactive protein, procalcitonin, presepsin and mid-regional pro-adrenomedullin. Clin Chem Lab Med. 2015 Jun 17. pii: /j/cclm.ahead-of-print/cclm-2015-0243/cclm-2015-0243.xml. doi: 10.1515/cclm-2015-0243.

12. Gurachevsky A., Kazmierczak S., et al. Application of Spin Label EPR in the diagnosis and prognosis of cancer and sepsis // Clin. Chem. Lab. Med. 2008. // 46(9);. P. 1203-1210.

13. Gurachevsky A., Shimanovitch E., Gurachevskaya Т., Muravsky V. Intra-albumin migration of bound fatty acid probed by spin label ESR. // Biochem Biophys. Res. Commun. 2007 Sep 7. 360(4). P. 852-856.

14. Muravsky V., Gurachevskaya Т., Berezenko S. Fatty acid binding sites of human and bovine albumins: Differences observed by spin probe ESR. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 2009. 74.

15. Muravsky V., Gurachevsky A., Matthes G. Disease specific albumin patterns defined by electron spin resonance. Tumor Biol. 28 (suppl. 1), 19 (2007). ISSN 1010-4283; 1423-0380

16. Paccolat C., Harbarth S., Courvoisier D., Irion O., de Tejada B.M. Procalcitonin levels during pregnancy, delivery and postpartum. 2011 Nov; 39(6):679-83. doi: 10.1515/JPM.2011.082. Epub 2011 Aug 11.

17. Soo-jin Ann, Ji Hyung Chung, Byung Нее Park, et al. PPAR-a agonists inhibit inflammatory activation of macrophagesthrough upregulation of b-defensin 1. 2014 г. Jun; 240(2).389-97. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2015.04.005. Epub 2015 Apr 7.

Описание чертежей

Фиг. 1. Данные динамического контроля DTE на 1 и 3-и сутки послеродового периода у женщин II группы.

Фиг. 2. ROC-анализ показателя детоксикационной эффективности альбумина при развитии послеродового эндометрита.

Фиг. 3. ROC-анализ СРБ при развитии послеродового эндометрита.