Результат интеллектуальной деятельности: Супрамолекулярный комплекс триклабендазола для лечения животных при фасциолёзе

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к гельминтологии, и может служить для профилактики и лечения животных при острой и хронической форме фасциолеза.

К числу наиболее распространенных и опасных паразитарных заболеваний животных и человека является фасциолез, который широко распространен в мире и на территории России. Заболевание протекает как остро, так и хронически, нередко с тяжелым клиническим течением.

Фасциолез наносит значительный экономический ущерб животноводству. Фасциолы, паразитируя в печени, вызывают тяжелые патологические изменения, особенно в период острого течения болезни.

Так, при фасциолезе экономический ущерб складывается от выбраковки печени, снижения молочной продуктивности на 10-15%, прироста массы молодняка на 5-20%, убойного выхода говядины на 3,28%, настрига шерсти овец на 10-18%, качества мяса на 100-300 ккал/кг и гибели животных, особенно, овец при острой форме заболевания.

В результате анализа имеющихся данных за последние годы средняя зараженность крупного и мелкого рогатого скота фасциолами по России составляет 28,6%, а в отдельных ее регионах достигает до 90,0% (A.M. Атаев, (1990) [2]; Архипов И.А., 2004 [1]; Е.Е. Коляда, (2004) [6]; В.В. Лошкарева, (2005) [4]; В.В. Горохов, (2012) [7] и др. [3, 5, 7, 8, 9].

Для дегельминтизации животных при фасциолезе предложено большое количество зарубежных антигельминтиков: рафоксанид, оксиклозанид, клозантел и отечественные лекарственные формы на их основе. Однако против молодых фасциол эти препараты не эффективны.

Единственным в ветеринарной и медицинской практике активным против молодых фасциол является импортный препарат фирмы «Сиба-Гейги» триклабендазол (фазинекс-5% суспензия), который нашел широкое применение за рубежом.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является субстанция Триклабендазола. Синонимы: (CGA 89317, фазинекс). Препарат более эффективен против молодых фасциол, однако эффективность триклабендазола с возрастом фасциол незначительно снижается. Терапевтическая доза триклабендазола для крупного рогатого скота составляет 12 мг/кг, а овец и коз 10 мг/кг. Задают препарат перорально с кормом или индивидуально в форме суспензии однократно [1, 4].

Недостатком выбранного прототипа является его высокая стоимость, в воде практически не растворим и до 70,0% выводятся из организма во внешнюю среду в неизменном виде с фекалиями, загрязняя окружающую среду.

Учитывая огромный экономический ущерб, вызываемый фасциолезом, весьма актуальным является разработка эффективных препаратов. Разработанные ранее в ВНИИП им. К.И. Скрябина препараты политрем против хронической и ацемидофен против острой формы фасциолеза в настоящее время не производятся, а импортный триклабендазол (фазинекс) в России практически не применяется из-за высокой стоимости.

В связи с этим целью нашей работы было получение отечественного препарата в виде супрамолекулярного комплекса на основе субстанции триклабендазола (ТКБ) и водорастворимых полимеров с применением современных нанотехнологий для повышения растворимости, биологической доступности триклабендазола, увеличения антигельминтной и экономической эффективности.

Предлагаемое антигельминтное средство (названное нами «Триклафасцид») получают с применением механохимической технологии в измельчителях ударно-истирающего типа с регулируемой энергонапряженностью. В качестве водорастворимого полисахарида используется арабиногалактан (АГ), выделяемый из лиственницы, который является экологически чистым и безопасным продуктом, который широко применяется в медицине и ветеринарии.

Получение супрамолекулярного комплекса с триклабендазолом включает следующие процессы:

1) Взвешивание компонентов (субстанция ТКБ и полисахарид АГ) в весовом соотношении 1:10 и предварительное смешивание в барабане, установленном на валках мельницы LE-101 в течение 10-15 мин;

2) Загрузка в барабан мелющих тел и активация смеси компонентов в течение 2 часов при вращении барабана со скоростью 90 об/мин до получения препарата триклафасцид;

3) Выгрузка препарата и фасовка в полиэтиленовые контейнеры с плотно закрывающими крышками по 100-500 г.

Полученный препарат Триклафасцид представляет собой супрамолекулярный комплекс типа «гость-хозяин» в виде сыпучего порошка размером от 0,1-10 микрон, светло-бежевого цвета с легким хвойным запахом и сладковатым вкусом. Триклафасцид, в отличие от субстанции триклабендазола, хорошо растворяется в воде, более удобен для применения и обладает следующими преимуществами:

1) Супрамолекулярный комплекс получают в одну стадию без участия жидких фаз в одну стадию, в отличие от ранее разработанного нами способа (используя ацетон или этиловый спирт [11]). Надо отметить, что при этом исключаются процессы растворения, осаждения, сушки продукта; нет жидких и твердых отходов.

2) Снижается стоимость обработки животного Триклафасцидом по сравнению с субстанцией триклабендазола в 8 раз, за счет снижения терапевтической дозы.

Известно, что нерастворимые в воде антигельминтики, применяемые животным перорально, до 70,0% выводятся во внешнюю среду в неизменном виде с фекалиями, загрязняя окружающую среду. Растворимый в воде супрамолекулярный комплекс Триклафасцид, применяемый в сниженной в 8 раз дозе, всасываясь в кровь, обеспечивает высокую биологическую доступность к паразитам. В дальнейшем, препарат расщепляется и выводится в основном с мочой из организма в мизерных количествах, не загрязняя окружающую среду.

Перечисленные положительные признаки полученного супрамолекулярного комплекса Триклафасцида по сравнению с прототипом субстанции триклабендазола обеспечивают соответствие технического решения критерию «новизна» и это позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «существенные отличия».

Примеры конкретного исполнения.

Пример 1. Получение супрамолекулярных комплексов на основе триклабендазола с использованием разных фармакопейных полимеров.

С цель получения наиболее оптимальной лекарственной формы с высокой антигельминтной и экономической эффективностью, нами наработаны 10 инновационных препаратов в виде супрамолекулярных комплексов на основе субстанции триклабендазола с различными водорастворимыми полимерами:

1) Триклабендазол/гидроксиэтилкрахмал (ТКБ/ГЭК)=1/10;

2) Триклабендазол/поливинилпирролидон (ТКБ/ПВП)=1/10;

3) Триклабендазол/арабиногалактан/фармакопейный (ТКБ/АГФ)=1/10;

4) Триклабендазол/арабиногалактан/технический (ТКБ/АГТ)=1/10;

5) Триклабендазол/натривая соль карбоксиметилцеллюлозы (ТКБ/Na КМЦ)=1/2;

6) Триклабендазол/двуокись кремния марки (вулкасил) (ТКБ/SiO₂)=1/2;

7) Триклабендазол/фукус (ТКБ/Ф)=1/4 и 1/10;

8) Триклабендазол/ламинария (ТКБ/Л)=1/4 и 1/10.

Пример 2. Получение суспензий триклабендазола с полимерами.

В валковой мельнице также были получены суспензионные формы триклабендазола с использованием различных вспомогательных компонентов (ПАВы, структурообразователи и др.) и полимеров. Составы полученных суспензий приведены ниже:

1) Триклабендазол/поливинилпирролидон, 10%-я суспензия ТКБ на основе ПВП;

2) Триклабендазол/арабиногалактан, 10%-я сусп. ТКБ на основе АГ.

Пример 3. Титрация полученных супрамолекулярных образцов ТКБ с полимерными наполнителями по параметрам острой токсичности.

Одним из важных параметров, разрабатываемых и внедряемых в практику препаратов является определение их токсичности.

В связи с этим нами проведен токсикологический скрининг препаратов, предлагаемых в рамках настоящей заявки.

Перед испытанием на домашних животных необходима проверка, включающая наиболее краткосрочные тесты, несущие необходимую информацию. В связи с этим для определения параметров острой токсичности нами были испытаны вышеотмеченные образцы ТКБ с различными полимерными наполнителями на 400 белых беспородных мышах, массой 18-20 г. Препараты вводили перорально в желудок с помощью специального зонда в дозах от 4000 до 20000 мг/кг. Каждую дозу препарата испытывали на 10 животных.

Определение параметров острой токсичности на белых мышах проводили методом Личфильда и Уилкоксона в модификации Рота (М.Л. Беленький, 1963) [5, 9], учитывая смертность животных от вводимых доз изучаемых препаратов с определением показателей: ЛД₀; ЛД₁₆; ЛД₅₀; ЛД₈₄; ЛД₁₀₀. Оценку степени опасности препаратов проводили согласно ГОСТ 12.1.007-76.

По результатам проведенных опытов установлено, что все 10 образцов ТКБ с разными полимерными наполнителями при энтеральном пути введения белым мышам согласно ГОСТ 12.1.007-76 относятся к IV классу безопасных веществ, из них наименьшую токсичность оказал ТКБ/АГ/Т (результаты отражены в таблице №1, приложение).

Пример 4. Испытание эффективности указанных в примере 1 и 2 образцов супрамолекулярных комплексов триклабендазола при фасциолезе овец.

Опыт №1 Испытание субстанции триклабендазола и его 5 супрамолекулярных комплексов проводили в Южном Федеральном округе на 67 овцах тушинской породы спонтанно инвазированных фасциолами.

Для определения степени инвазированности животных были отобраны пробы фекалий индивидуально и исследованы методом Фюллеборна с определением количества яиц фасциол в среднем г/фекалий. Отобранные в опыт спонтанно инвазированные фасциолами овцы были распределены по принципу аналогов на 6 подопытных по 10 (п=10) овец и контрольную (п=7) группы. Животные первой подопытной группы получали базовый препарат субстанцию триклабендазола в дозе 10,0 мг/кг по ДВ в форме водной взвеси. Вторая - ТКБ - 10% суспензию на основе ПВП, третья - ТКБ/ПВП=1/10, четвертая - ТКБ/SiO₂=1/10, пятая - ТКБ/ГЭК=1/10, шестая - ТКБ/NaКМЦ=1/10. Все эти препараты хорошо суспендируют в воде и представляют из себя растворимые порошки. Седьмая группа овец получала 10%-ю суспензию. Препараты, вводили индивидуально однократно в дозе 10 мг/кг по порошку или по 1,0 мг/кг по действующему веществу (ДВ), в форме водных суспензий. Восьмая группа овец препарат не получала, так как служила контролем. После дачи препаратов в течение 3-х дней за животными проводили клинические наблюдения.

Для определения эффективности через 25 дней после дачи препарата были взяты пробы фекалий индивидуально от подопытных и контрольной группы животных и исследованы аналогично подбору животных в опыт.

Учет эффективности лекарственных форм триклабендазола проводили по типу "контрольный тест", согласно Руководству, одобренному Всемирной Ассоциацией за прогресс ветеринарной паразитологии (1995) [10].

Результаты испытания комплексов триклабендазола с полимерами сведены в таблицу №2, из которой видно, что базовый препарат триклабендазол в дозе 10 мг/кг по ДВ освободил 9 из 10 животных, экстенсэффективность (ЭЭ) при этом составила 90,0%, а интенсивность яиц фасциол в г/фекалий снизилась (ИЭ) на 99,0%. 10,0%-я суспензия ТКБ на основе ПВП в дозе 1,0 мг/кг по ДВ оказала ЭЭ, равную 90,0%, ИЭ=97,4%. Остальные препараты показали следующие результаты: комплекс ТКБ/ПВП=1/10 показал ЭЭ=90,0% и ИЭ=97,5%; ТКБ/SiO₂=1/10 - ЭЭ=80,0%, ИЭ=94,5%; ТКБ/ГЭК=1/10 - ЭЭ=70,0%, ИЭ=95,4%; ТКБ/NaКМЦ=1/10 - ЭЭ=70,0%, ИЭ=87,9%. У животных контрольной группы количество яиц в г/фекалий составило в среднем 104,7±7,8 экз.

Таким образом, супрамолекулярные комплексы ТКБ проявили высокую эффективность против фасциол в дозах в 10 раз меньше по сравнению с базовым препаратом. В процессе работы было отмечено, что комплекс ТКБ/ГЭК=1/10 при высокой атмосферной влажности и температуре свыше +30°C слеживается, а для комплекса ТКБ/NaКМЦ=1/2 необходимо время для набухания полимера, что повышает затраты времени при массовой дегельминтизации индивидуально, в водном растворе ТКБ/SiO₂=1/2 отмечается легкий осадок двуокиси кремния.

Все испытанные образцы супрамолекулярных комплексов триклабендазола животными переносились хорошо, отклонений от физиологической нормы и побочных действий нами не отмечены.

Опыт №2. Испытание эффективности предлагаемых супрамолекулярных комплексов ТКБ/АГТ=1/10, ТКБ/АГФ=1:10, ТКБ/Л=1/10 ТКБ/Ф=1:10 проводили на 58 овцах тушинской породы, спонтанно инвазированных фасциолами. Отобранные в опыт овцы были распределены по принципу аналогов на 5 подопытные по (n=10-12) животных в группе. Животные первой подопытной группы получали ТКБ/АГТ=1/10, вторая - ТКБ/АГФ=1:10, третья - ТКБ/Ф=1:10, четвертая - ТКБ/Л=1/10. Все выше указанные препараты представляют из себя тонкодисперсные порошки, которые легко образуют суспензии при смешении с водой. Все четыре образца вводили в дозе 10 мг/кг по препарату, а по ДВ 1,0 мг/кг в форме водного раствора, пятая группа овец получала базовый препарат ТКБ в дозе 1,0 мг/кг по ДВ, как контроль. Препараты давали индивидуально перорально однократно из полиэтиленовой бутылки.

Учет эффективности комплексов триклабендазола проводили аналогично опыту №1.

Результаты испытания эффективности субстанции триклабендазола и его комплексов сведены в таблицу №3, из которой видно, что базовый препарат триклабендазол в дозе 1,0 мг/кг (в 10 раз уменьшенной терапевтической дозе) эффективности не проявил - 27,9%.

Комплекс ТКБ/АГТ=1:10 освободил от фасциол 11 из 12 животных; экстенсэффективность при этом равна 91,6%, а интенсивность яиц фасциол в г/фекалий снижена на 96,6%. Аналогично другие комплексы ТКБ показали следующие результаты: ТКБ/АГФ=1/10 - ЭЭ=91,6% и ИЭ=96,5%; ТКБ/Ф=1:10 - ЭЭ=83,3%, ИЭ=93,9%; ТКБ/Л=1/10 - ЭЭ=91,6%, ИЭ=96,6%.

Надо особо отметить, что испытанные комплексы триклабендазола проявили большую эффективность против фасциол по сравнению с базовым препаратом. В процессе работы было отмечено, что ТКБ/Ф=1/10 и ТКБ/Л=1/10 при смешивании с водой образуют густые гелеобразные массы, с которыми работа затруднена. Поэтому их лучше давать в сухой смеси с кормом.

Все испытанные лекарственные формы триклабендазола животными переносились хорошо, отклонений от физиологической нормы и побочных действий нами не отмечено.

Подводя итоги испытаниям супрамолекулярных комплексов триклабендазола, было установлено, что все образцы по параметрам острой токсичности при энтеральном пути введения белым мышам согласно ГОСТ 12.1.007-76 относятся к IV классу безопасных веществ.

Испытание эффективности супрамолекулярных комплексов триклабендазола показало их достаточно высокую экстенсэффективность (70,0-100%) на спонтанно инвазированных фасциолами овцах в дозе 1,0 мг/кг по ДВ, что в 10 раз ниже терапевтической нормы самой субстанции триклабендазола.

Из разработанных и испытанных образцов препарата необходимо было отобрать один образец для дальнейшего испытания с целью внедрения его в ветеринарную практику, который отвечал бы по следующим параметрам, как антигельминтная и экономическая эффективность, транспортировка, хранение, растворимость в воде; запах, вкус, светочувствительность, доступность для приобретения отечественного полимерного компонента.

По всем вышеперечисленным параметрам нами был отобран супрамолекулярный комплекс триклабендазола на основе отечественного полисахарида арабиногалактан-технический, условно названный нами "Триклафасцид".

Опыт №3. Титрация терапевтической дозы супрамолекулярного комплекса Триклафасцид.

Для титрации терапевтической дозы супрамолекулярного комплекса триклабендазол на основе АГТ "Триклафасцид" были отобраны 40 спонтанно инвазированных фасциолами овец тушинской породы, которые по принципу аналогов были распределены на 4 подопытные группы по 10 (n=10) животных в каждой. Первая группа овец получала Триклофасцид в дозе 10 мг/кг по препарату (по ДВ 1,0 мг/кг), вторая - 15 (по ДВ 1,5 мг/кг), третья - 20 мг/кг (по ДВ 2,0 мг/кг), четвертая группа овец получала базовый препарат субстанцию триклабендазола в терапевтической дозе 10 мг/кг для контроля. Препараты вводили индивидуально перорально, однократно в форме водного раствора.

В течение проведения опыта после дачи препаратов животные находились в одинаковых условиях содержания и кормления, за ними проводили клинические наблюдения.

Учет эффективности проводили через 25 суток после дачи препаратов по данным копроовоскопических исследований, методом «критический тест».

Результаты эффективности препаратов сведены в таблицу №4, из которой следует, что Триклафасцид в дозе 20 мг/кг по препарату (по ДВ 2,0 мг/кг) проявил 100%-ю эффективность против половозрелых фасциол, это в 8 раз уменьшенная доза по сравнению с субстанцией триклабендазола при терапевтической дозе 10 мг/кг.

Таким образом, исходя из проведенного опыта, наименьшая доза супрамолекулярного комплекса Триклафасцид, при которой получена 100%-я эффективность, является 2,0 мг/кг по ДВ (20 мг/кг по препарату), и она установлена нами, как терапевтическая при хронической форме фасциолеза овец.

Опыт №4. Испытание эффективности супрамолекулярного комплекса Триклафасцид против преимагинальных (неполовозрелых) фасциол.

С целью определения эффективности препарата на неполовозрелые формы фасциол использовали метод оценки эффективности испытуемых препаратов с определением содержания яиц фасциол в фекалиях у подопытных животных в процессе лечения и по выраженному увеличению содержания яиц после начала лечения и последующему их исчезновению в фекалиях леченных животных, выявляя эффективность препарата.

Это метод основан на феномене раннего и выраженного повышения концентрации яиц гельминтов в фекалиях инвазированных животных под влиянием эффективных антигельминтных препаратов. Животные, инвазированные фасциолами, но не достигшие половой зрелости, в фекалиях яйца фасциол в начале не регистрируются, а после лечения в результате разложения фасциол под действием препарата появляется повышение концентрации не сформировавшихся яиц серого цвета и последующее их исчезновение в фекалиях можно считать, что животное излечилось, а испытуемый препарат рассматривается как эффективный.

Для этого было отобрано в опыт 76 молодых животных первого года выпаса на неблагополучных по фасциолезу пастбищах, у которых в фекалиях не было обнаружено яиц фасциол, но предположительно инвазированные фасциолами, которые были дегельминтизированы супрамолекулярным комплексом триклафасцид в дозе 1,0 мг/кг по ДВ.

Эффективность препарата определяли по данным копроовоскопии, через 3; 7; 14 и 25 сутки после дачи препарата.

В результате оценки эффективности препарата по выраженному увеличению содержания яиц фасциол после начала лечения по сравнению с исходным показателем и последующему исчезновению яиц в фекалиях леченных животных было установлено, что у 76 животных первого года выпаса, которые были свободны от яиц фасциол по данным копроовоскопии, после дачи препарата Триклафасцид в дозе 1,0 мг/кг у 30 из них на 3 сутки были обнаружены недозрелые яйца (серого цвета) фасциол в среднем г/фек. 266,0 экз. На 7-е - 158,0 экз.; 14 - 0,93 экз., на 25 сутки яиц фасциол не обнаружено.

Следовательно, Триклафасцид в дозе 1,0 мг/кг проявил более высокую 100%-эффективность против преимагинальных (неполовозрелых) фасциол.

По клиническим признакам, после дачи препарата побочных действий нами не отмечено: температура тела, пульс, дыхание и жвачка были в пределах нормы, животные были активны в движениях, принимали корм и воду.

Простой экономический расчет, показывает достаточно высокую эффективность ТКБ/АГ/Т из-за снижения терапевтической дозы в 8 раз, так как из 1 кг субстанции ТКБ можно приготовить 10 кг ТКБ/АГ/Т=1/10.

Если 1 кг субстанцией ТКБ в терапевтической дозе 10 мг/кг можно обработать в расчете на одну овцу при средней живой массе 40 кг, 2500 животных, то 10 кг ТКБ/АГ/Т полученного из 1 кг субстанции ТКБ в терапевтической дозе 2 мг/кг - 12500 животных.

В результате ТКБ/АГ/Т можно обработать на 10000 овец больше, чем субстанцией ТКБ. Стоимость обработки одной овцы субстанцией ТКБ составляет 38 руб., а ТКБ/АГ/Т - 7,60 рублей, то есть 5 раз дешевле.

Заключение

Путем механохимической обработки (в измельчителях ударно-истирающего типа) субстанции триклабендазола с полимерами получены 10 супрамолекулярных комплексов типа «гость-хозяин». Комплексы представляют собой тонкодисперсные легко сыпучие порошки с размером частиц до 10 микрон.

По результатам титрации по параметрам острой токсичности установлено, что все комплексы при энтеральном пути введения белым мышам согласно ГОСТ 12.1.007-76 относятся к IV классу малотоксичных веществ, из них меньшую токсичность оказал ТКБ/АГ/Т.

Все испытанные супрамолекулярные образцы триклабендазола против половозрелых в 8, а неполовозрелых фасциол овец 9 раз эффективнее, чем субстанция базового препарата ТКБ.

По техническим и экономическим причинам наиболее оптимальным препаратом выбран комплекс ТКБ/АГТ=1/10 (Триклафасцид), перспективный для внедрения в ветеринарную практику. В пользу данного образца говорит и тот факт, что арабиногалактан, как известный биологически активный полисахарид, используется для повышения биодоступности, очищает организм, нормализует пищеварительный тракт, повышает иммунитет при иммунодифицитах, поддерживает нормальный баланс микрофлоры пищеварительного тракта, является питательной средой для благотворных бактерий, чрезвычайно важных для защиты слизистой оболочки желудка от патогенных организмов. Фасциолы, локализуясь в желчных протоках, вызывают их утолщение (обызвествление), жировую дистрофию и цирроз печени, а арабиногалактан обладает заметными гепатопротекторными и мембранотропными свойствами, его можно применяться в качестве терапевтического средства, предназначенного для лечения печени.

Таким образом, заявленное антигельминтное средство «Супрамолекулярный комплекс триклабендазола с техническим арабиногалактаном» обладает хорошей растворимостью, в 8 раз эффективнее, чем базовый препарат триклабендазол, при этом повышается и экономическая эффективность.

Список использованных источников

1. Архипов И.А. Антигельминтики: фармакология и применение // М. - 2009. - 406 с.

2. Беленький М.Л. // Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л., Медгиз, 1963. - 152 с.

3. Горохов В.В. Прогноз эпизоотической ситуации в РФ по основным гельминтозам на 2014 год // Российский паразитол. журнал, 2014, №2 - С. 32-33.

4. Демидов Н.В. Антгельминтики в ветеринарии // М., 1982 - 362 с.

5. Каган Ю.С., Станкевич В.В. // Актуальные вопросы гигиены труда, промышленной токсикологии в нефтяной и нефтехимической промышленности. - Уфа, 1984. - С. 48-49.

6. Коляда Е.Е. Эпизоотология и терапия фасциолеза и дикроцелиоза крупного рогатого скота в Среднем Поволжье: Автореф. дис. канд. вет. наук - М., 2004. - 25 с.

7. Лошкарева В.В. Маритогония трематод у крупного рогатого скота и оптимизация сроков применения антигельминтиков в условиях Среднего Предуралья: Автореф. дис. вет. наук. - М., 2005. - 25 с.

8. Люблина Е.И. Рекомендации по статистической обработке результатов экспериментально-токсикологических исследований. - М.: Ин-т гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР. - 1986.

9. Медведь Л.И., Каган Ю.С., Спыну Е.И. // Пестициды и проблемы здравоохранения. - Вестник Всес. хим. о-ва им. Менделеева. - 1968, 13, №3. - С. 263-271.

10. Методические рекомендации по доклиническому изучению репродуктивной токсичности фармакологических средств, одобренные фармакологическим комитетом Минздрава России (протокол №8 от 3 июля 1997) и утвержденные Минздравом России 18 декабря 1997.

11. Патент №2524652, Бюл. №21, 27.07.2014 г.

12. Патент №2560516, Бюл. №23, 21.07.2015 г.

13. Патент №2546535, Бюл., №10, 10.04.2015 г.

14. Патент №2558922, Бюл. №22, 10.09.2015 г.