Способ стимуляции репаративной регенерации печени после ее резекции

Предлагаемый способ относится к медицине, а именно к гепатологии и патофизиологии, и может быть использован для стимуляции репаративной регенерации печени крыс после ее резекции.

В настоящее время резекции ткани широко применяются при лечении очаговых новообразований печени (Вишневский В.А. Операции на печени: руководство для хирургов. 2003. М.: Миклош. - 155 с.). Наиболее часто встречающимся новообразованием печени является первичный рак (Дзидзава И.И., Слободяник А.В., Ионцев В.И. Осложнения после обширных резекций печени// Вестник Российской военно-медицинской академии.- 2015. - Т. 51, №3. - С. 261-266). Распространенность этой формы патологии зависит от частоты встречаемости вирусных гепатитов В и С и составляет от 3 до 25 случаев заболеваний на 100000 населения (там же). Однако даже в странах с низким уровнем заболеваемости отмечается ее рост. Однако выполнение массивных резекций печени часто сопровождается развитием тяжелого осложнения - пострезекционной печеночной недостаточности (Вишневский В.А., Коваленко Ю.А., Андрейцева О.И., Икрамов Р.З., Ефанов М.Г., Назаренко Н.А., Тупикин К.А. Пострезекционная печеночная недостаточность: современные проблемы определения, эпидемиологии, патогенеза, оценки факторов риска, профилактики и лечения// Украинский журнал хирургии.- 2013. - №3. - С. 172-183). Летальность при таких вмешательствах колеблется в широких пределах, но по-прежнему остается достаточно высокой. Одним из эффективных путей снижения тяжести пострезекционных осложнений является стимуляция восстановления объема функционирующей ткани, поскольку известно, что печеночная ткань обладает высокой регенераторной активностью (Mangnall D., Bird N.C., Majeed A.W. The molecular physiology of liver regeneration following partial hepatectomy// Liver International. - 2003.- V. 23, N. - P. 124-138). Регенерация печени после обширной гепатэктомии осуществляется за счет пролиферации оставшихся гепатоцитов, при этом утраченные доли не формируются заново (Сидорова В.Ф., Рябинина З.А., Лейкина Е.М. Регенерация печени у млекопитающих. 1966 г. М.: Медицина. 205 с.). Ранее показано, что способностью к регенерации обладают не только гепатоциты, но клетки билиарных протоков, Купферовские, звездчатые, эндотелиальные клетки (Fausto N. Liver regeneration// Hepatology. 2000.- V. 32. - P. 19-31). Восстановление объема органа идет за счет ускорения митотического деления, полиплоидизации и гипертрофии гепатоцитов (Stanger B.Z. Organ size determination and the limits of regulation// Cell Cycle.- 2008. - V. 7, N 3. - P. 318-324). Известно, что процесс регенерации печени после частичной гепатэктомии контролируется целым каскадом ростовых факторов, цитокинов, транскрипционных факторов, однако наиболее важными из них являются фактор роста гепатоцитов, эпидермальный фактор роста, трансформирующий фактор роста-альфа, ангиогенные факторы (Mangnall D., Bird N.C., Majeed A.W. The molecular physiology of liver regeneration following partial hepatectomy// Liver International. - 2003. - V. 23, N. - P. 124-138) Фактор роста гепатоцитов играет ключевую роль, поскольку индуцирует переход гепатоцитов в фазу митотического цикла (Ельчанинов А.В., Фахрутдинов Т.Х., Макаров А.В., Глинкина В.В., Большакова Г.Б. Регенерация печени млекопитающих// Клиническая и экспериментальная морфология. 2012. - №4. - С. 57-61). В неактивном состоянии он присутствует в матриксе ткани печени в значительных количествах, и после гепатэктомии под влиянием урокиназы и ферментов семейства металлопротеаз фактор роста гепатоцитов активируется и запускает деление гепатоцитов. Интересным представляется факт, что эпидермальный фактор роста действует в основном на начальной стадии регенерации печени, а трансформирующий фактор роста-альфа - на поздних этапах. Ранее показано, что регенерация ткани печени сопровождается сокращением длительности фаз митотического цикла (там же). Пролиферация гепатоцитов характеризуется определенными особенностями и зависит от возраста животных (там же). У молодых особей латентный период начала пролиферации клеток печени значительно короче по сравнению со взрослыми. Пик пролиферативной активности у них достигается значительно быстрее. Кроме того, у новорожденных особей наблюдаются 2 таких пика (Fausto N. Liver regeneration// Hepatology. 2000. - V. 32. - P. 19-31). Другой особенностью пролиферации гепатоцитов является зависимость скорости митозов от времени суток (Сидорова В.Ф., Рябинина З.А., Лейкина Е.М. Регенерация печени у млекопитающих. 1966. М: Медицина. 205 с.). Наибольшая интенсивность пролиферации клеток печени регистрируется в период с 6 до 9 часов утра и устанавливается в течение месяца после рождения, что совпадает с типом секреции генов биологических часов: Bmal-1, Clock, Per 1-2, Cry 1-2) в печени.

В связи с вышесказанным становится очевидной актуальность поиска новых средств, активирующих регенераторную способность ткани печени.

Наиболее близким является способ стимуляции репаративных процессов с помощью трипептида H₂N-Gly-L-His-L-Lys-COOH, запатентованного как средство, стимулирующее репаративные процессы при воздействии токсических факторов (Смахтин М.Ю., Швейнов А.И., Конопля А.А., Северьянова Л.А., Бобынцев И.И.//Способ стимуляции физиологической и репаративной регенерации печени. - патент РФ №2214269, 2002).

Применение трипептида H₂N-Gly-L-His-L-Lys-COOH, кратко именуемого Gly-His-Lys, в дозах 1,5 мкг/кг, 50 мкг/кг и 150 мкг/кг оказывает стимулирующее влияние на физиологическую регенерацию печени, что подтверждается повышением митотического индекса гепатоцитов. Причем эффект применяемого пептида не зависел от использованной дозы, однако с увеличением дозы пептида отмечалось усиление дистрофических процессов в паренхиме печени.

При токсическом отравлении тетрахлорметаном применение трипептида Gly-His-Lys в дозах 1,5 мкг/кг, 50 мкг/кг и 150 мкг/кг стимулировало репаративную регенерацию гепатоцитов, что проявлялось повышением митотического индекса клеток. Эффект пептида в дозе 1,5 мкг/кг характеризовался уменьшением степени дистрофических изменений гепатоцитов.

Недостатком предложенного способа является то, что указанное средство может быть использовано для стимуляции физиологической или репаративной регенерации печени при ее токсических поражениях. Авторами не представлено данных о влиянии трипептида на репаративную регенерацию печени после резекции части органа. В то же время все более широкое распространение получает оперативное лечение заболеваний печени, когда выполняются обширные резекции органа.

Технический результат изобретения - разработать способ стимуляции репаративной регенерации печени с целью восстановления ее функциональной активности при резекциях печени.

Технический результат изобретения достигается тем, что экспериментальному животному (крысе), которому была выполнена частичная гепатэктомия (резекция 70% ткани печени), парентерально (внутрибрюшинно) вводят растворенный в физиологическом растворе (ФР) хлорида натрия пептид динорфин А (1-13) (Н-Тир-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг-Арг-Иле-Арг-Про-Лиз-Лей-Лиз) в дозе 20,1 мкг/кг массы тела пятикратно с интервалом в 24 часа между инъекциями. Изучение увеличения массы печени на разных сроках после частичной гепатэктомии свидетельствует о стимуляции репаративной регенерации.

В разработанном авторами способе стимуляции репаративной регенерации печени используется селективный агонист опиоидных каппа-рецепторов динорфин А (1-13), обладающий гепатопротективным действием при стрессе, и подобраны такая доза и кратность введения, при которых проявляется стимулирующий эффект пептида на репаративную регенерацию печени. Динорфин А (1-13) легко проникает через гемато-энцефалический барьер (Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н., Райс К. Проницаемость гематоэнцефалического барьера для лигандов опиоидных рецепторов. Экспериментальная и клиническая фармакология.- 2002. - Т. 65, №4. - С. 71-77), а значит, его эффекты связаны с активацией как центральных, так и периферических рецепторов. Ранее показано, что динорфин А (1-13) оказывает наиболее выраженное по сравнению с селективными агонистами других классов опиоидных рецепторов антиоксидантное действие в ткани печени (Солин А.В., Ляшев Ю.Д. Влияние опиоидных пептидов на содержание продуктов ПОЛ и активность антиоксидантной системы в печени крыс, подвергшихся иммобилизационному стрессу// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153, №6. - с. 803-805, Солин А.В., Ляшев Ю.Д. Влияние опиоидных пептидов на процессы перекисного окисления липидов при длительном стрессе// Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2012. - Т. 98, №8. - С. 1016-1020).

В настоящий момент поскольку точно известна химическая формула этого пептида, он может быть синтезирован в любой лаборатории синтеза пептидов либо куплен у фирм, занимающихся поставкой биологически активных соединений (Sigma, ICN, Merk и др.). Нами использован препарат, синтезированный в лаборатории синтеза пептидов Кардиологического научного центра РАН, г. Москва).

Изобретение поясняется следующими фигурами.

На фиг. 1. Представлена гистограмма, демонстрирующая стимулирующий эффект динорфина А(1-13) на репаративную регенерацию печени после обширной гепатэктомии. В каждой группе было по 6 животных. * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой; *** - р<0,001 по сравнению с контрольной группой.

На фиг. 2. Представлена фотография брюшной полости крысы после выполненной 70% гепатэктомии. Хорошо виден купол диафрагмы, культи резецированных долей печени, правая и хвостатые доли печени, желудок, петли кишечника.

На фиг. 3. Представлена микрофотография участка печени крысы на 7 сутки после резекции. Дистрофия гепатоцитов. Двуядерные гепатоциты. Гепатоциты, содержащие несколько ядрышек. Окраска гематоксилин + эозин. Увеличение ×400.

Способ осуществляется следующим образом. В качестве модели частичной гепатэктомии авторами выбрана модель, предложенная Higgins G. М. и Anderson R.M. (1931). Согласно этому методу масса хирургически удаленной ткани печени составляет 70%. Указанная модель традиционно используется в экспериментальных исследованиях, связанных с резекцией ткани печени.

В экспериментах по стимуляции репаративной регенерации печени использован пептид динорфина А (1-13), растворенный в изотоническом растворе хлорида натрия и разведенный до получения необходимой дозы 20,1 мкг/кг массы тела. Выбор указанной дозы объясняется предшествующими экспериментами, показавшими высокую антиоксидантную активность динорфина А (1-13), и торможение при его введении перекисного окисления липидов в ткани печени при стрессе (Солин А.В., Ляшев Ю.Д. Влияние опиоидных пептидов на содержание продуктов ПОЛ и активность антиоксидантной системы в печени крыс, подвергшихся иммобилизационному стрессу// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153, №6. - с. 803-805, Солин А.В., Ляшев Ю.Д. Влияние опиоидных пептидов на процессы перекисного окисления липидов при длительном стрессе// Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2012. - Т. 98, №8. - С. 1016-1020). В этих работах проводилось сравнительное изучение влияния селективных агонистов отдельных классов опиоидных рецепторов на перекисное окисление липидов, поэтому изучаемые опиоидные пептиды, в том числе и динорфин А (1-13), применяли в эквимолярных дозах. Для динорфина А (1-13) такая доза составила 20,1 мкг/кг.

Динорфин А (1-13) вводили внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл экспериментальному животному, которому предварительно была выполнена частичная гепатэктомия (удаление 70% массы органа), один раз в день на протяжении 5 суток с интервалом 24 часа. В результате проведенных исследований установлено, что применение динорфина А (1-13) в дозе 20,1 мкг/кг вызывает увеличение массы печени на 1, 3 и 7 сутки после выполнения частичной гепатэктомии. Гистологическое изучение препаратов ткани печени экспериментальных животных, которым была выполнена частичная гепатэктомия, в разные периоды после операции (1, 3, 7 сутки) показало, что увеличение массы органа связано с регенерацией гепатоцитов. Можно утверждать, что такой стимулирующий эффект на пролиферацию гепатоцитов носит положительный характер, так как ускоряет восстановление массы органа и предупреждает развитие печеночной недостаточности.

Пример конкретного выполнения

Пример. Стимуляция репаративной регенерации печени путем применения динорфина А (1-13) в дозе 20,1 мкг/кг.

Крысам Вистар была выполнена частичная гепатэктомия - резекция 70% массы печени по методу, описанному Higgins G. М. и Anderson R.M. (1931). Операция заключается в удалении левой боковой и медиальной долей, что составляет около 70% ткани печени (Фиг. 2). Правая и хвостатая доли после операции начинают регенерировать. Восстановление массы органа связано с увеличением массы именно этих долей.

Выжившие после операции крысы были разделены на 2 группы по 18 особей в каждой. Контрольной группе внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в объеме 0,2 мл. Опытной группе - динорфин А (1-13) в дозе 20,1 мкг/кг. Пептид предварительно растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл. И раствор динорфина А (1-13), и физиологический раствор вводили один раз в день в течение пяти дней, начиная со дня выполнения резекции. Животных выводили из эксперимента на 1, 3 и 7 сутки после частичной гепатэктомии. Определяли относительную массу хвостатой и правой долей и печени, а также выполняли микроскопическое исследование срезов печени, окрашенных гематоксилином и эозином.

У контрольных животных уже на 3 сутки отмечается практически двукратное увеличение относительной массы печени (отношение массы органа в день забоя к исходной массе органа, выраженное в процентах). А на 7 сутки относительная масса органа составляла 86,2±1,7%. В группе крыс Вистар, которым была выполнена частичная гепатэктомия и получавших динорфин А (1-13) в дозе 20,1 мкг/кг, относительная масса печени была на 22,2% выше, чем в контрольной группе (р<0,001) уже на первые сутки после операции. Эта тенденция наблюдалась и на 3 сутки эксперимента - относительная масса печени превышала аналогичный показатель в контрольной группе на 7,6% (р<0,05). На 7 сутки относительная масса печени у крыс, которым вводили динорфин А (1-13), не только статистически достоверно (р<0,001) была выше, чем в контрольной группе, но и превышала исходную масса печени до операции. При микроскопическом исследовании установлено, что увеличение массы печени связано с репаративной регенерацией паренхимы органа, что проявлялось статистически достоверным увеличением числа двуядерных гепатоцитов. Как показывают представленные результаты, динорфин А (1-13) проявляет стимулирующий эффект на репаративную регенерацию печени после частичной гепатэктомии (Фиг. 3).

Таким образом, пептид динорфин А (1-13) в дозе 20,1 мкг/кг массы тела, введенный пятикратно с интервалом в 24 часа между инъекциями, может быть использован для стимуляции репаративной регенерации печени при ее резекциях у экспериментальных животных.