Результат интеллектуальной деятельности: Галогениды 1-(4-трет-бутилфенил)-2-{ 3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3Н-бензимидазол-1-ил} этанона, обладающие свойством разрывателей поперечных сшивок гликированных белков

Изобретение относится к новым производным в ряду бензимидазола, а именно к неописанным ранее галогенидам 1-(4-трет-бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3H-бензимидазол-1-ил}этанона формулы 1:

где Hal - в том числе хлор или бром.

Изобретение относится к области медицины и биологически активным веществам, способным функционировать в качестве разрывателей поперечных сшивок (РПС) гликированных белков, и может быть использовано в первую очередь в комплексной терапии сахарного диабета и его осложнений. Протекающие при сахарном диабете патологические процессы в качестве одного из важнейших компонентов включают чрезвычайно деструктивную по своим последствиям неферментативную реакцию гликирования протеинов, приводящую к накоплению гликопротеинов. Последние ответственны за резкое снижение функциональных свойств эритроцитов и весьма серьезные сосудистые осложнения диабета. У больных сахарным диабетом гликированию, в ходе которого происходит сшивание протеиновых макромолекул с глюкозой, подвергаются в первую очередь долгоживущие структурные белки, особенно, в связи с повышенным уровнем глюкозы [1, 2]. Гликирование представляет собой довольно медленный процесс, на заключительном этапе которого происходит сшивка гликопротеидов с образованием меж- или внутримакромолекулярных связей гликированного белка.

Следует отметить, что гликирование белков, пептидов и других макромолекул связывают не только с диабетом, но и со старением, с нейродегенеративной амилоидной болезнью (болезнью Альцгеймера), а также с развитием катаракты.

Потеря функциональности белков вследствие их гликирования связана с тем, что образование в белках поперечных сшивок, как правило, приводит к значительному уменьшению их эластичности. В результате клетки крови, в частности эритроциты, сосуды, кожа становятся жесткими и в значительной мере теряют свою функциональность. У здоровых людей, по мере старения, этот процесс происходит довольно медленно, тогда как у больных сахарным диабетом, он резко ускоряется из-за повышенной концентрации глюкозы. Одним из последствий старения и диабета является также увеличение жесткости коллагеновой основы сердечно-сосудистой системы [3]. Крупные артерии теряют свою эластичность и становятся жесткими, что приводит к систолической гипертонии и в конечном итоге сердечной недостаточности. Неферментативное гликозилирование коллагеновой матрицы происходит постепенно, как в процессе старения, так и при диабете. Одним из последствий перекрестного связывания коллагена является сниженная восприимчивость к протеолитическому и химическому разложению. Это приводит к повышенному накоплению поперечно сшитого коллагена, потере его эластичности и, как результат, к ишемической болезни сердца (ИБС) [4]. Результаты многочисленных исследований подтверждают мнение, что инфаркт является итогом гликирования коллагеновой матрицы [4, 5].

Известно нормализующее действие на пораженное гликированием русло сердечно-сосудистой системы четвертичных азолиевых солей, в том числе хлорида N-фенацил-4,5-диметилтиазолия (препарат ALT-711, алагебриум), который снижает уровень конечных продуктов гликирования (КПГ) в кровеносных сосудах [5]. В ходе клинических испытаний алгебриума было показано, что препарат обладает хорошей переносимостью и вызывает увеличение эластичности сосудов у 93% пациентов старше 50 лет [4].

Наиболее близкими по структуре среди производных 2-метилбензимидазола являются гидробромиды 1-алкил-3-фенацилпроизводные 2-метилбензимидазола, обладающие противомикробной активностью [6], противоопухолевой активностью [7].

В ряду фенацилпроизводных 2-метилбензимидазола не известны соединения, проявляющие свойства разрушителей поперечных сшивок гликированных белков.

Техническим результатом изобретения является не описанное ранее соединение в ряду фенацилпроизводных 2-метилбензимидазола, проявляющее новое для данного ряда свойство разрушителей поперечных сшивок гликированных белков.

Технический результат достигается соединением формулы 1.

В качестве галогенидов 1-(4-трет-бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3H-бензимидазол-1-ил}этанона могут выступать, в том числе, хлорид или бромид.

Синтез соединений 1 заключается в алкилировании 2-метилбензимидазола 4-фторфеноксиэтилбромидом и последующей кватернизацией образующегося 1-(4-фторфенокси)этил-2-метилбензимидазола 2 2-замещенными 1-(4-трет-бутилфенил)этанонами при кипячении в нитрометане:

Ниже приведен пример синтеза бромида предлагаемого соединения.

Стадия 1. 1-(4-фторфенокси)этил-2-метилбензимидазол

К раствору 1.32 г (10 ммоль) 2-метилбензимидазола и 1.3 г (20 ммоль) КОН (в расчете на 85% содержание КОН) в 10 мл ДМСО порциями вносят 2.19 г (10 ммоль) 2-(4-фторфенокси)этилбромида так, чтобы температура реакционной массы не превышала 45°С. Смесь выдерживают 1 час при 45°С, затем температуру поднимают до 115°С и сразу охлаждают и выливают в 20 мл воды. Выпавшие слегка розоватые кристаллы 1-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метилбензимидазола отфильтровывают, промывают 5 мл воды. Выход 2.37 г (88%). Т. пл. 133-135°С (из изопропанола).

Спектр ЯМР ¹Н (300 МГц), δ, м.д. (CDCl₃): 2.33 (с, 3Н, СН₃), 4.25 (т, 2Н, J = 4.2, ОСН₂), 4.34 (т, 2Н, J = 4.3, NCH₂), 6.70-6.77 (м, 2Н, Н-2'¹, Н-6'), 6.89-6.95 (м, 2Н, Н-5, Н-6), 7.10-7.19 (м, 3Н, Н-3', Н-5', Н-4), 7.42 (д, 1H, J = 7.6, Н-7).

Найдено (%):N 10.12. C₁₆H₁₅FN₂O. Вычислено (%): N 10.36.

Стадия 2. 1-(4-трет-Бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3H-бензимидазол-1-ил}этанона бромид

(¹ цифрами со штрихом обозначены протоны феноксиэтильного заместителя в положении 1 бензимидазола, с двумя штрихами – фенильного в положении 3 бензимидазола)

К раствору 0.54 г (20 ммоль) 2-метил-1-[2-(4-фторфенокси)этил]бензимидазола в 15 мл нитрометана при 35°C прибавляют 0.53 мл (21 ммоль, 0.54 г) 2-6ром-1-(4-трет-бутилфенил)этанона, кипятят 1 час, охлаждают и отфильтровывают 0.90 г (87%) бромида 1-(4-трет-бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3H-бензимидазол-1-ил}этанона. Бесцветные кристаллы с т. пл. 208°C (из изопропанола). Спектр ЯМР ¹H (600 МГц), δ, м.д. (ДМСО-d₆): 1-34 (с, 9Н, C(СН₃)₃), 2.93 (с, 3H, CH₃), 4.36 (т, 2Н, J=4.5, OCH₂), 5.06 (т, 2Н, J=4.5, NCH₂), 6.42 (с, 2Н, CCH₂), 6.88-6.92 (м, 2Н, Н-3', 5'), 7.11 (т, 2Н, J=8.7, Н-2',6'), 7.60-7.70 (м, 4Н, Н-4, Н-5, Н-6, Н-7), 8.00 (д, J=8.1, 1Н, Н-3'' или Н-5''), 8.08 (д, 2Н, J=8.4, Н-2'',6''), 8.15 (д, 1H, J=8.1, H-5'' или H-3'').

Найдено (%): N 5.04. C₂₈H₃₀BrFN₂O₂. Вычислено (%): N 5.32.

Исследование биоактивности

Получение коллагена

Для получения коллагена крыс линии Вистар (масса тела 200±20 г) наркотизировали, после чего иссекали хвосты при температуре 4°C и вынимали коллагеновые волокна сухожилия хвоста, которые промывали физиологическим солевым раствором, удаляли ткани неколлагеновых волокон, трижды промывали дистиллированной деионизованной водой, разрезали на куски и при 4°C погружали в 0.1% раствор уксусной кислоты на одну неделю, в течение которой иммерсионную жидкость часто взбалтывали. Иммерсионную жидкость подвергали обработке на центрифуге при 8000 g в течение 30 минут и собирали супернатантный раствор коллагена. После разбавления измеряли содержание протеина. 96-луночный микропланшет (Costar) тщательно покрывали раствором коллагена в количестве 70 мкг/лунку при 4°C в течение 24 часов, затем пленкообразующий раствор удаляли. Пластины высушивали на воздухе, покрывали пленкой для сохранения свежести и хранили при 4°C до использования.

Получение конечных продуктов гликирования (гликированного бычьего сывороточного альбумина - БСА)

Раствор, содержащий 50 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) (V) (Roch) и 0.5 М глюкозы в 0.2 М забуференном фосфатом физиологическом растворе (фосфатный буферный раствор) (pH 7.4), инкубировали при 37°C в стерильных условиях в течение 3-4 месяцев для образования, таким образом, гликозилированного БСА. В то же время готовили негликозилированный БСА со свободным от глюкозы БСА. Затем БСА-AGE раствор диализировали против 0.01 М фосфатный буферный раствор (pH 7.4) для удаления непрореагировавшей глюкозы. Использовали флуоресцентное сканирование (Exi/Em (395/460 нм)).

Исследование активности бромида 1-(4-трет-бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3H-бензимидазол-1-ил}этанона (1)

Покрытый коллагеном из хвоста 96-луночный микропланшет тщательно обрабатывали фосфатным буферным раствором (pH 7.4) в течение 1 часа для нейтрализации кислого коллагена. Планшет блокировали Superblock (PIERCE) при 37°C в течение 1 часа и промывали фосфатным буферным раствором с Tween-20, трижды встряхивая в течение 1 минуты при каждом промывании. 100 мкл раствора гликированного белка добавляли в лунки в ряды 96-луночного планшета, маркированные как A, B, C и D, и раствор БСА такой же концентрации добавляли в лунки в ряды, маркированные как E, F, G и H. Лунки инкубировали при 37°C в течение 4 часов, чтобы обеспечить сшивание коллагена, и промывали фосфатным буферным раствором с tween-20 четыре раза при встряхивании в течение 1 минуты при каждом промывании. Испытываемое соединение добавляли к выполненным в четырех экземплярах лункам с гликированным белком и к выполненным в четырех экземплярах лункам с БСА в количестве 100 мкл/лунку. В первые три лунки в каждом ряду вместо вещества добавляли 100 мкл/лунку фосфатный буферный раствор или другой растворитель (например, ДМСО). Лунки инкубировали при 37°C в течение 16 часов и промывали фосфатным буферным раствором с tween-20, встряхивая в течение 1 минуты во время каждого промывания. В лунки добавляли антитела кролика против-БСА (1:500) 80 мкл/лунку и планшет инкубировали при 37°C в течение 50 минут. Далее в лунки добавляли 80 мкл/лунку меченных пероксидазой хрена козьих IgG против кроличьих (1:1000). Лунки инкубировали при 37°C в течение 50 минут. После добавляли субстрат 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) 100 мкл/лунку. Планшет инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 20 минут. Для прекращения реакции использовали 2М раствор H₂SO₄. В течение 10 минут после реакции регистрировали оптическую плотность при 450 нм на планшет-ридере TECAN M200Pro.

Для каждого определения вычисляли среднюю оптическую плотность (ОП).

Корректированная ОП = средняя ОП лунки с гликированным белком - средняя ОП лунки БСА.

Процент разрушения выражали в виде относительного уменьшения ОП:

[(средняя ОП лунки фосфатный буферный раствор - средняя ОП лунки исследуемого соединения)/средняя ОП лунки фосфатный буферный раствор] × 100%.

Обработка результатов выполняется в программе Microsoft Excel (Microsoft, США) с расчетом базовых статистических показателей: среднего арифметического M, стандартного отклонения s, стандартной ошибки среднего арифметического m. Статистическая обработка с применением парного t-критерия Стьюдента в программе Statistika 10.0 (StatSoft, США).

Результаты исследования

На фиг. 1 показана зависимость разрывающей активности бромида 1-(4-трет-бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3H-бензимидазол-1-ил}этанона (1) от его концентрации. По оси абсцисс - концентрация соединения 1, ммоль; по оси ординат - ингибирование флюоресценции, %; количество опытов - n=5. R² - квадрат коэффициента корреляции для регрессионного уравнения (показывает статистическую значимость расчетов) = 0, 9402. IC₅₀ (концентрация полумаксимального ингибирования) = 0.387 ммоль/л. Значение получают из уравнения регрессии (y=65.52x+24.655), связывающее эффект y с концентрацией x, при y=50. На фиг. 2 показана зависимость разрывающей активности препарата сравнения ALT-711 от его концентрации. По оси абсцисс - концентрация соединения ALT-711, ммоль/л; по оси ординат - ингибирование флюоресценции, %. (n=5). IC₅₀ = 1.89 ммоль/л.

В таблице 1 приведены значения концентрация полумаксимального ингибирования (IC₅₀) 1-(4-трет-бутилфенил)-2-{3-[2-(4-фторфенокси)этил]-2-метил-3H-бензимидазол-1-ил}этанона бромида (1) в сравнении с референсным препаратом алагебриумом (ALT-711).

Как видно, для соединения 1 значение IC₅₀ составляет 0,387 ммоль/л, что превосходит IC₅₀ для ALT-711 в 4.9 раз.

Таким образом, производные бензимидазола обладают свойствами разрывателей поперечных сшивок гликированных белков, превосходя препарат сравнения алагебриум в 4.9 раза.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ансари Н.А., Рашид З. //Биомедицинская химия. - 2010. - Т. 56. - №. 2. - С. 168-178.

2. Ли Сун и др. Патент РФ 2444517 (2012), Бюл. №7 (2012).

3. А.А. Спасов, А.И. Ращенко // Вестник ВолгГМУ. 2016. - Т. 57 - №1. - с. 12-15.

4. Vasan S., Foiles P., Founds H. // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 2003. - T. 419. - №. 1. - C. 89-96.

5. Kim J. et al. // European journal of pharmacology. - 2015. - T. 748. - C. 108-114. Singh R. et al. // Diabetologia. - 2001. - T. 44. - №. 2. - C. 129-146.

6. Воев В.Л. и др, Хим.-фарм. журнал, 1990. Т. 24, №11, с. 40-44.

7. Xiao-Liang Xu, Org. Biomol. Chem., 2015, V. 13, P. 1550; Jin-Mei Liu, RSC Advances, 2015, Issue78.