Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА И РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ, ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ И ЗАЩИТЫ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ В АРИДНОЙ ЗОНЕ

Изобретение относится к сельскому хозяйству, сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии и предназначено для стимуляции роста растений, повышения урожайности и защиты от фитопатогенных грибов в аридной зоне.

Самые современные способы повышения урожайности и защиты растений от болезней основаны на использовании микроорганизмов: бактерий, микромицетов и микроводорослей. Микроводоросли и цианобактерии применяют в виде аксеничных или альгологически чистых культур.

Известен Штамм цианобактерий Nostoc muscorum f. linckia (Roth) Born et. Flash 28-1 106 - активный несимбиотический азотфиксатор из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии для повышения урожайности растений риса [патент РФ №1180366]. Семена риса инокулировались известным штаммом, выращивались в условиях микроделяночного опыта и определялась урожайность растений.

Недостатками известного метода являются:

- узкий спектр свойств цианобактерий - обладает только стимулирующими свойствами;

- использование одного вида растений - рис;

- низкая урожайность, составляющая 18%.

Наиболее близким, по сути, к заявленному изобретению (прототипом) является способ стимуляции развития, роста и продуктивности растений с применением альгологически чистой культуры Chlorella vulgaris [патент РФ №2448453].

Недостатками известного способа являются:

- отсутствие фунгицидной и антиоксидантной активности культуры;

- осложненный периодический пролив растений в течение всего цикла выращивания растений.

Основной задачей изобретения является создание эффективной технологии выращивания растений, обеспечивающей стимуляцию роста и развития, повышение урожайности и защиту от фитопатогенных грибов в аридных условиях.

Техническим результатом от использования изобретения является увеличение всхожести семян, повышение энергии роста, повышение урожайности растений, защита от фитопатогенов, оздоровление растений и почв, обусловленное наличием антиоксидантных свойств цианобактерий в условиях аридного климата.

Технический результат обеспечивается тем, что семена и растения перед высадкой в грунт обрабатывают суспензией цианобактерий Anabaena constricta IPPAS В-2020 с концентрацией 5 г сухой биомассы цианобактерий на 1 л воды в течение 1 ч и обеспечивают пролив под корень в фазу 2-4 настоящего листа и в фазу цветения и бутонизации растений. Альгологически чистая культура цианобактерий Anabaena constricta IPPAS В-2020 выделена с помощью метода накопительных культур из ризосферы древесного растения Ясеня пенсильванского L., произрастающего в аридной зоне на территории Астраханского региона. Культура цианобактерий хранится на среде BG-11. Состав среды: (г/л): K₂HPO₄ - 0,04; MgSO₄⋅7H₂O - 0,075; CaCl₂⋅2Н₂О - 0,036; Na₂CO₃ - 0,02; ЭДТА - 0,001; лимонная кислота - 0,006; железо лимонно-аммиачное-0,006; микроэлементы - 1 мл [Нетрусов, А.И. Практикум по микробиологии [Текст]: учеб. пособие для высших учеб. заведений / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук [и др.] / Под ред. А.И. Нетрусова. - М.: Академия, 2005. - 352 с.].

Сырую и сухую биомассу цианобактерий для приготовления суспензии получали следующим образом. Цианобактерии Anabaena constricta IPPAS В-2020 культивировали в вихревом биореакторе при температуре 28°С в течение 5 суток при 60 об/мин с люминесцентной лампой (4000 кельвин). Посевной материал вносили в количестве 20% от ее общего объема. За это время происходило максимальное наращивание биомассы - 47 мг/м²/ч сухого вещества. Затем биомассу высушивали в термостате при температуре 37°С до постоянного веса и измельчали.

Культура цианобактерий Anabaena constricta IPPAS В-2020 депонирована в Коллекции культур микроводорослей (IPPAS) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН под номером IPPAS В-2020. Справка о депонировании прилагается.

Клетки цианобактерий сине-зеленые, цилиндрические, посередине обычно перешнурованные. Ширина клеток 5,0-6,5 мкм; длина клеток 3,0-4,4 мкм, встречается длина 5-7 мкм. Гетероцисты круглые шаровидные, 5-7 мкм в диаметре. Споры неизвестны.

Способ стимуляции роста и развития растений, повышения урожайности и защиты от фитопатогенных грибов с применением цианобактерий апробирован в лаборатории биотехнологий ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет», полевых экспериментах на открытом грунте на территории технопарка ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет» п. Начало Астраханской области и на территории Всероссийского научно-исследовательского института орошаемого овощеводства и бахчеводства ФГБНУ ВНИИОБ, г. Камызяк Астраханской области. Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1. Исследование фунгицидных свойств культуры цианобактерий Anabaena constricta IPPAS В-2020.

Фунгицидную активность культуры цианобактерий исследовали с помощью метода лунок на фитопатогенных грибах Fusarium graminearum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium culmorum, Fusarium poae, Alternaria tenuissima, Pythium ultimum, предоставленных ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии. В лунки помещали супензию цианобактерий в концентрации 5 г абсолютно сухой биомассы цианобактерий на 1 л стерильной дистиллированной воды, в качестве контроля вносили дистиллированную воду. Также в опыте использовали водно-спиртовый экстракт цианобактерий в концентрации 100 мг абсолютно сухой биомассы цианобактерий на 1 мл жидкости (разведение спирта с водой 1/1). В качестве контроля использовали разведение спирта с водой 1/1. Опыты проводили в четырех повторностях. В таблице 1 показан диаметр зоны задержки роста грибов цианобактериями.

Анализ полученных данных показал, что спектр зон подавления роста фитопатогенных грибов колеблется в пределах от 6,0 до 33,0 мм. Наибольший диаметр зоны задержки роста гриба отмечен при использовании суспензии цианобактерий по отношению к Fusarium culmorum - 33,0 мм и Fusarium poae - 28,2 мм. Водно-спиртовый экстракт в большей степени подавлял развитие Fusarium sporotrichioides с зоной 27,3 мм (при микроскопировании отмечен лизис мицелия).

Пример 2. Исследование антиоксидантных свойств цианобактерий Anabaena constricta IPPAS В-2020 фотометрическим методом.

Антиоксидантную активность (АОА) определяли методом оценки колориметрии свободных стабильных радикалов, основанном на реакции DPPH ДФПГ (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (C₁₈H₁₂N₅O₆, М=394,33), растворенного в этаноле, с образцом антиоксиданта (АН) по схеме:

DPPH*+АН→DPPH-Н+А*

DPPH (ДФПГ) - тест проводили фотометрическим методом с 0,5 мМ спиртовым раствором DPPH (Sigma-Aldrich) при длине волны 510 нм на спектрофотометре «ПромЭкоЛаб» ПЭ - 5300. Для приготовления рабочих растворов применяли 96% этиловый спирт. Измерения проводили через 60 минут. Для измерения готовили следующие растворы:

- в качестве контроля (без присутствия антиоксиданта): 1500 мкл 96% этилового спирта + 500 мкл 0,5 мМ раствора ДФПГ;

- с присутствием антиоксиданта (исследуемых жидкостей): 1480 мкл 96% этилового спирта + 500 мкл 0,5 мМ раствора ДФПГ + 20 мкл исследуемого вещества;

- с присутствием антиоксиданта (исследуемых жидкостей): 1400 мкл 96% этилового спирта + 500 мкл 0,5 мМ раствора ДФПГ + 100 мкл исследуемого вещества.

Для исследования антиоксидантных свойств цианобактерий готовили следующие растворы:

- культуральную жидкость цианобактерий;

- водный экстракт в концентрации 100 мг абсолютно сухой биомассы цианобактерий на 1 мл воды;

- водно-спиртовый экстракт в концентрации 100 мг абсолютно сухой биомассы цианобактерий на 1 мл жидкости (разведение спирта с водой 1/1). Антиоксидантную активность (I, %) вычисляли по формуле:

I(%)=(А₀-А₁)/А₀×100,

где А₀ - оптическая плотность в контроле,

A₁ - оптическая плотность исследуемых жидкостей.

Данные исследования антиоксидантной активности представлены в таблице 2.

Выраженной антиоксидантной активностью обладает водный экстракт цианобактерий в объеме 20 мкл 39,34%, а также водный и водно-спиртовый экстракты в объеме 100 мкл. Приготовленные исходя из специфичности метода растворы (культуральная жидкость и экстракты) позволили выявить антиоксидантные свойства цианобактерий.

Пример 3. Исследование фитотоксичности и фитостимуляции цианобактерий Anabaena constricta IPPAS В-2020

Фитотоксичность и фитостимулирующие свойства цианобактерий исследовали с помощью теста на семенах кресс-салата согласно ГОСТ 12038-84. Семена кресс-салата помещали в чашки Петри с фильтровальной бумагой и ватой (влажные камеры) в трех повторностях. Предварительно проводили стерилизацию семян, обработав 70% этанолом в течение 3-5 мин, после чего отмывали 3 раза стерильной дистиллированной водой. В каждую камеру помещали 50 семян, которые увлажняли суспензией с концентрацией 5 г абсолютно сухой биомассы цианобактерий на 1 л стерильной дистиллированной воды. Контрольные семена замачивались в стерильной дистиллированной воде. Семена, обработанные суспензией и дистиллированной водой проращивали в течение трех суток в люминостате и температуре 25°С. Результаты представлены в таблице 3.

Всхожесть обработанных семян на 12% больше, чем в контроле. Длина корня при обработке цианобактериями превышает контроль в среднем на 1,4 см. Длина стебля при бактеризации цианобактериями выше на 0,5 см, чем в контроле.

Пример 4. Исследование фитостимулирующей активности цианобактерий Anabaena constricta IPPAS В-2020 в открытом грунте на перце болгарском

Опыты проводили в открытом грунте на территории технопарка ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет», п. Начало Астраханской области на семенах перца сорта «Калифорнийское чудо». Растения высаживали на 3-рядовых делянках. Расстояние между растениями 40 см. В каждом варианте высаживали 50 растений в трехкратной повторности. Продолжительность опыта 4 месяца. Схема опыта включала варианты: двукратная обработка цианобактериями - бактеризация семян и пролив в фазу 2-4 настоящего листа (без внесения удобрений); контроль - без внесения удобрений. Значение температуры в течение опыта составило от 10 до 40°C.

Для обработки семян и растений перца использовали альгологически чистую культуру цианобактерий вида Anabaena constricta IPPAS В-2020 в виде суспензии (5 г абсолютно сухой биомассы цианобактерий на 1 л стерильной дистиллированной воды). Перед посевом проводили бактеризацию семян, которые выдерживали в течение 1 часа в суспензии с цианобактериями, а контрольные семена - в воде.

В течение опыта на стадии плодоношения замеряли длину корня, высоту растений, массу одного плода, количество плодов и урожайность.

Результаты представлены в таблице 4.

Растения, обработанные суспензий цианобактерий, значительно превышали контрольные по длине корня и высоте растений.

Отмечено ускоренное созревание плодов у обработанных растений на 5-8 дней по сравнению с контролем. Из таблицы 5 видно, что масса одного плода перца и количество плодов при обработке суспензией цианобактерий превышает контрольную массу. Урожайность перца в контроле составила 0,143±0,27 кг/куст, а при обработке суспензией составила 0,272±0,12 кг/куст.

Из таблицы 6 видно, что количество обработанных суспензией цианобактерий растений составило 0%, а в контроле 9%, что подтверждает высокую фунгицидную активность культуры цианобактерий.

Пример 5. Пример способа стимуляции роста и развития, повышения урожайности и защиты от фитопатогенных грибов растений томатов в открытом грунте.

Опыты проводили в открытом грунте на территории Всероссийского научно-исследовательского института орошаемого овощеводства и бахчеводства ФГБНУ ВНИИОБ г. Камызяк Астраханской области на семенах томатов сорта «Дар Заволжья». Растения высаживали в ряды - 10 растений/ряд, расстояние между рядками - 40 см. Расстояние между растениями 40 см. В каждом варианте высаживали 50 растений в трехкратной повторности. Продолжительность опыта 3 месяца. Схема опыта включала варианты: трехкратная обработка цианобактериями - бактеризация семян, пролив в фазу 2-4 настоящего листа, пролив в фазу цветения и бутонизации растений (без внесения удобрений); контроль - без внесения удобрений. Значение температуры в течение опыта составило от 10 до 40°C.

Перед посевом проводили бактеризацию семян томатов, которые выдерживали в течение 1 часа в суспензии с цианобактериями, а контрольные семена - в воде. Для получения суспензии 5 г абсолютно сухой биомассы альгологически чистой культуры цианобактерий вида Anabaena constricta IPPAS В-2020 вносили в 1 л стерильной дистиллированной воды, тщательно перемешивали. В фазу 2-4 настоящего листа и в фазу цветения и бутонизации растений осуществляли пролив под корень в количестве 10-15 мл суспензии на одно растение.

В течение опыта на стадии плодоношения определяли урожайность растений и количество урожайных кустов. Отмечено ускорение плодообразования обработанных растений на 5-8 дней раньше, чем без обработки.

В результате количество урожайных кустов в контроле составило 31,73%, в опыте составило 38,82% (табл. 7). Урожайность томатов в контроле составила 0,31 кг/куст, а при обработке суспензией составила 1,14 кг/куст.

Из таблицы 8 видно, что количество обработанных суспензией цианобактерий растений составило 0%, а в контроле 12%, что подтверждает высокую фунгицидную активность культуры цианобактерий.

Таким образом, заявленный способ обеспечивает стимулирование роста и развития растений, повышение урожайности, защиту от фитопатогенных грибов и оздоровление агрокультур.