ПРАЙМЕР И СПОСОБ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО ТЕСТИРОВАНИЯ С ПОМОЩЬЮ СУСПЕНЗИОННЫХ МИКРОЧИПОВ ПАТОГЕНОВ, ПЕРЕДАЮЩИХСЯ КЛЕЩАМИ

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способу недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами.

Предпосылки изобретения

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой протокол амплификации нуклеиновых кислот in vitro, разработанный в середине 1980-х, и также является часто используемой в настоящее время техникой для тестирования нуклеиновых кислот. Способ, применяемый для тестирования ПЦР-продукта, представляет собой электрофорез в агарозном геле (AGE), при этом с помощью AGE можно разделять ДНК-фрагменты с различающимся размером около 100 п.о. При помощи AGE невозможно разделить ПЦР-продукты с длинами фрагментов, мало отличающимися или идентичными друг другу. Кроме того, с помощью AGE определяют наличие ПЦР-продукта путем возбуждения флуоресцентного красителя ультрафиолетовым светом с образованием флуоресцентного свечения, при этом чувствительность данного тестирования является относительно низкой. Также с помощью AGE определяют продукты по их размеру, что характеризуется низкой специфичностью и не дает возможность разделять фрагменты одинаковых размеров, полученные с помощью неспецифической амплификации. Более того, красители, обычно применяемые для электрофореза, такие как этидия бромид, представляют собой канцерогены, таким образом, являясь вредными для здоровья при постоянном контакте.

Клещ является кровососущим паразитом, который паразитирует на поверхности тела животных. Как один из самых важных переносчиков заболеваний клещ представлен различными видами, которые широко распространены, и имеют много жизненных форм, а также способны к поражению различных хозяев, таких как птицы, рептилии, млекопитающие и т.п., и способны к распространению многих видов патогенов, при этом большинство заболеваний, вызванных распространением патогенов, являются серьезными природно-очаговыми заболеваниями и зоонозами, и для большинства этих болезней не существует эффективной вакцины, что наносит большой ущерб человеческому здоровью и животноводческому хозяйству. Исследование способа недиагностического тестирования заболеваний, передающихся клещами, в дальнейшем должно расширяться, и в настоящее время необходимо создать удобный и эффективный способ недиагностического мультиплексного тестирования заболеваний, передающихся клещами, с высокой чувствительностью и большой специфичностью. Предыдущие исследования были направлены на тестирование одного вида патогена, и некоторые методы недиагностического тестирования в предшествующем уровне техники были недостаточно чувствительны для раннего выявления большинства случаев инфекционных заболеваний, передающихся клещами; и, кроме того, с точки зрения биологической классификации, патогены, передающиеся клещами, относятся к различным микроорганизмам, таким как бактерии, вирусы, риккетсии, спирохеты и т.п., и в настоящее время большинство тестов на патогены, передающиеся клещами, направлено только на один вид патогена, и такие тесты выполняют специалисты из различных областей классификации патогенов в соответствии со своими профессиональными сферами, что является тратой человеческих ресурсов и денег, и независимое внедрение тестирования в соответствующие профессиональные области не выгодно для принятия комплексных контролирующих мер с высокой эффективностью. Поэтому тестирование патогенов, передающихся клещами, нужно рассмотреть комплексно, в связи со множеством факторов.

Суспензионный микрочип, также называемый жидким микрочипом или жидким чипом, является очень гибкой многофункциональной технологической платформой, которая дает возможность проведения исследований, таких как определение биологических макромолекул типа белков и нуклеиновых кислот, а также идентификация и анализ рецепторов и лигандов. При помощи суспензионного микрочипа выполняют качественный и количественный анализ тестируемого объекта посредством флуоресцентных кодированных микросфер, способных к соединению с зондом, и тестирование через два лазерных луча, при этом для достижения мультиплексного тестирования нуклеиновых кислот 100 видов различных биологических реакций могут быть осуществлены в одной реакционной ячейке. Однако известный способ недиагностического тестирования с помощью суспензионных микрочипов требует больших затрат времени и имеет сложные этапы. В связи с наличием мультиплексного зонда при мультиплексном тестировании выбор температуры гибридизации также является затруднением в развитии технологии.

Краткое описание изобретения

Для решения проблем, существующих в предшествующем уровне техники, целью настоящего изобретения является обеспечение способа недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, с высокой чувствительностью и большой специфичностью.

Для достижения вышеуказанной цели настоящее изобретение предусматривает способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, в частности, включающий следующие этапы:

1) разработка специфического праймера для тестирования, соответствующего нуклеотидной последовательности ПЦР-амплифицированного участка, внесение в GenBank для определения специфичности праймера, связывание в процессе синтеза 5'-конца прямого праймера со специфической этикеткой (Tag) и биотиновое мечение 5'-конца обратного праймера;

2) гибридизация продуктов реакции с соответствующими кодированными микросферами соответственно после завершения ПЦР;

3) специфическое захватывание Tag-последовательности ПЦР-продукта с помощью анти-Tag на микросферах при определенных условиях;

4) добавление стрептавидин-фикоэритрина для связывания с биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами, тестирование продукта с применением системы суспензионных микрочипов LUMINAX и проведение качественного и количественного анализа тестируемого объекта возбуждением красной флуоресценции в среде микросфер и возбуждением фикоэритрина, связанного посредством определенных реакций на поверхности микросфер, где праймерная последовательность представлена следующим образом.

Кроме того, необходимо искусственно добавлять участок метки к 5'-концу прямого праймера путем соединения их с помощью вставочной последовательности, и 5'-конец обратного праймера метить биотином.

Более того, гибридизацию осуществляют в условиях 37°С с одновременным добавлением микросфер, ПЦР-амплифицированного продукта и стрептавидина-фикоэритрина (SA-PE), в то же время в этих условиях можно осуществлять связывание между стрептавидин-фикоэритрином и биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами.

Улучшенный способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, включает следующие этапы:

1) проведение ПЦР-амплификации тестируемого образца;

2) добавление соответствующих микросфер для гибридизации с ПЦР-амплифицированным продуктом;

3) тестирование гибридизированных микросфер с помощью прибора;

где определенный праймер для тестирования разработан соответственно тестируемому вирусу, где 5'-конец прямого праймера связан со специфической Tag, С9 или С18 включается между прямым праймером и Tag как дополнительное плечо и 5'-конец обратного праймера метится биотином.

Кроме того, праймерная последовательность представлена следующим образом.

Кроме того, необходимо искусственно добавлять участок метки к 5'-концу прямого праймера путем соединения их с помощью вставочной последовательности, и 5'-конец обратного праймера метить биотином.

Более того, гибридизацию осуществляют в условиях 37°С с одновременным добавлением микросфер, ПЦР-амплифицированного продукта и SA-PE, в то же время в этих условиях может осуществляться связывание между стрептавидин-фикоэритрином и биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами.

Также для амплификации необходимы следующие условия:

В настоящем изобретении раскрыт высокопроизводительный способ недиагностического тестирования, в котором применяется система на основе суспензионных микрочипов в качестве платформы для специфической идентификации патогенов, передающихся клещами, при помощи комбинации технологии мультиплексной ПЦР и этикетка (Tag)-технологии с высокой чувствительностью и высокой специфичностью тестирования, обеспечивающими основу для мониторинга заболеваний, передающихся клещами, а также тестирование и предупреждение возникновения новых патогенов, передающихся клещами, способных распространяться в нашей стране.

Краткое описание графических материалов

На фигуре 1 представлена кривая зависимости доза-эффект интенсивности флуоресценции на поверхности кодированных микросфер от плотности ДНК, где в определенном диапазоне интенсивность флуоресценции на поверхности кодированных микросфер положительно коррелирует с количеством добавленной матрицы, где горизонтальная координата отображает количество матричной ДНК, добавленное в пробирку для мультиплексной ПЦР, и вертикальная координата отображает интенсивность флуоресценции на поверхности соответствующих кодированных микросфер. Полуколичественный анализ нуклеиновых кислот проводили с помощью аппроксимации стандартной кривой.

На фигуре 2 проиллюстрированы результаты тестирования вируса клещевого энцефалита, вируса синьцзянской геморрагической лихорадки, Rickettsiae группы пятнистой лихорадки, Babesia spp., Ehrlichia, Francisella tularensis, Rickettsia австралийской лихорадки Q, Borrelia burgdorferi и Bartonella с помощью способа, разработанного в настоящем изобретении; где ось X отображает тестируемый образец, ось Y отображает тестируемые микросферы и ось Z отображает измеренный флуоресцентный сигнал (MFI).

Подробное описание вариантов осуществления

Настоящее изобретение проиллюстрировано более подробно, как указано далее, со ссылкой на прилагаемые графические материалы, где иллюстративные варианты осуществления представлены в прилагаемых графических материалах. Однако настоящее изобретение может быть осуществлено в различного рода формах и, таким образом, при рассмотрении не должно ограничиваться приведенными здесь примерами вариантов осуществления. В действительности, представленные варианты осуществления даны для того, чтобы сделать настоящее изобретение целостным и завершенным и в полной мере передать суть настоящего изобретения специалисту в данной области.

Настоящее изобретение описывает способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, а также относится к усовершенствованиям способа недиагностического тестирования с помощью суспензионных микрочипов и к условиям реакции, и этапам способа ПЦР, и, в частности, к внедрению вырожденных праймеров в тестирование с помощью суспензионных микрочипов. Чип, применяемый в этом способе, в основном состоит из микросфер с последовательностями Tag, биотинилированного праймера, праймера с Tag и стрептавидин-фикоэритрина, при этом способ включает следующие этапы: осуществление амплификации мультиплексной ПЦР с получением меченых мультиплексных целевых продуктов с применением прямого праймера с Tag и обратного праймера с биотинилированным концом и осуществление множественной гибридизации посредством специфичности связывания между последовательностями Tag и усреднения температуры гибридизации, где не только захват микросферами ПЦР-продуктов, но также и связывание стрептавидин-фикоэритрина и биотина на ПЦР-продуктах, захваченных микросферами, достигается в процессе гибридизации, и затем стимулирование распределения флуоресценции в среде микросфер с использованием красного лазера для определения типа ПЦР-продукта на основании разных цветов сред микросфер, возбуждение фикоэритрина с применением зеленого лазера и измерение количества зарегистрированных флуоресцирующих молекул, связанных в среде микросфер для косвенного определения содержания ПЦР-продуктов, связанных в средах микросфер.

В TAG-технике по настоящему изобретению применяется Tag, которая содержит только три основания и таким образом не может быть связана ни с одной природной ДНК и ПЦР-продуктом, таким образом, обеспечивается специфичность процесса гибридизации и усреднение условий гибридизации, а также процесс тестирования становится более удобным и эффективным. Настоящее изобретение в основном направлено на всестороннее тестирование различных патогенов, переносимых взятым из природы клещом, таких как вирус клещевого энцефалита и Rickettsia австралийской лихорадки Q. Высокопроизводительное тестирование, осуществляемое при обработке образцов взятых из природы клещей одной партии для определения патогенов, передающихся клещами, экономно и эффективно, что может способствовать упрощению тестирования, стадий мониторинга и процедур контроля заболеваний и мер предупреждения для повышения эффективности и уменьшения количества повторной работы. Настоящее тестирование также может быть использовано для экспресс-теста патогенов, переносимых с объектами импорта и экспорта из-за границы или с пищевыми продуктами и т.д.

Настоящее изобретение предусматривает способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, включающий:

во-первых, разработку специфического праймера для тестирования в соответствии с нуклеотидной последовательностью ПЦР-амплифицированной области, внесение праймера в GenBank для определения специфичности праймера, связывание в процессе синтеза 5'-конца прямого праймера со специфической Tag и мечение биотином 5'-конца обратного праймера;

гибридизацию продуктов реакции с соответствующими кодированными микросферами соответственно после завершения ПЦР;

специфическое захватывание Tag-последовательности ПЦР-продукта с помощью анти-Tag микросфер при определенных условиях;

затем добавление стрептавидин-фикоэритрина для связывания с биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами, тестирование с применением системы суспензионных микрочипов LUMINAX и проведение качественного и количественного анализа тестируемого объекта посредством возбуждения красной флуоресценции в среде микросфер и возбуждением фикоэритрина, связанного посредством определенных реакций на поверхности микросфер.

В указанном способе необходимо искусственно добавлять участок метки к 5'-концу прямого праймера путем связывания их с помощью вставочной последовательности и 5'-конец обратного праймера необходимо метить биотином. Гибридизацию осуществляют в условиях 37°С с одновременным добавлением микросфер, ПЦР-амплифицированного продукта и SA-PE, в то же время в этих условиях можно осуществлять связывание между стрептавидин-фикоэритрином и биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами.

Настоящее изобретение также предусматривает способ мультиплексной ПЦР, способный эффективно амплифицировать 9 видов патогенов, передающихся клещами, включающий следующие этапы:

1. разработка специфического праймера для тестирования в соответствии с нуклеотидной последовательностью ПЦР-амплифицированной области, выравнивание праймера с применением программного обеспечения BIOEDIT и внесение праймера в GenBank для определения специфичности праймера;

2. разработка некоторых праймеров для патогенов в виде вырожденных праймеров для лучшей избыточности тестирования и положительных результатов тестирования всех патогенов, относящихся к соответствующему виду;

3. присоединение 5'-конца прямого праймера к специфической Tag, включение С9 или С18 между прямым праймером и Tag как дополнительное плечо в процессе синтеза и мечение 5'-конца обратного праймера биотином;

4. составление реакционной системы ПЦР согласно оптимизированному соотношению и осуществление амплификации при оптимизированных условиях.

Настоящее изобретение также предусматривает улучшенный способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, включающий следующие этапы: 1. проведение ПЦР-амплификации тестируемого образца; 2. добавление соответствующих микросфер для гибридизации с ПЦР-амплифицированным продуктом и 3. тестирование гибридизированных микросфер на приборе.

Оптимизированная система и оптимизированные условия амплификации, включенные в способ ПЦР-амплификации по настоящему изобретению, выглядят следующим образом.

Условия амплификации:

В настоящем изобретении способ добавления соответствующих микросфер для гибридизации с ПЦР-продуктом включает

1. добавление 3500 микросфер каждого типа микросфер, имеющих метки анти-Tag, в раствор для гибридизации, так что общее количество микросфер составляет 35 мкл, и затем вычисление соответствующего количества, которое следует добавить согласно результатам подсчета микросфер;

2. добавление 5-17 мкл соответствующих ПЦР-продуктов, полученных при использовании ДНК патогенов, передающихся клещами, в качестве матриц в соответствующие пробирки и затем равномерное перемешивание смеси многократным пипетированием;

3. затем добавление 4 нг/мкл SA-PE в 1 × растворе ТМАС в каждую лунку с получением общего объема 80 мкл;

4. гибридизацию в течение определенного времени при 37°С;

5. перенос гибридизированного продукта на пластину фильтра для фильтрации несвязанных ПЦР-продуктов путем всасывания и затем добавление 80 мкл 1 × раствора ТЕ в каждую лунку и осциллирование для ресуспендирования микросфер;

6. тестирование продукта на приборе после завершения реакции. Систему Bio-PlexTM применяют для тестирования, где численность микросфер определяют возбуждением красной флуоресценции в среде микросфер и количественный анализ связанных ПЦР-продуктов проводят при помощи возбуждения фикоэритрина на поверхности микросфер.

По сравнению с традиционным способом недиагностического ПЦР-тестирования настоящее изобретение имеет преимущество в том, что:

1. благодаря системе усиления сигнала в устройстве и усилению функции биотин-авидина чувствительность тестирования ПЦР-продуктов настоящего изобретения выше, чем при электрофорезе в агарозном геле (AGE);

2. благодаря захватыванию ПЦР-продуктов специфическими зондами специфичность тестирования по настоящему изобретению намного выше, чем при способе, с помощью которого ПЦР-продукты определяют на основании длины фрагментов;

3. настоящее изобретение может быть использовано для разделения и идентифицирования фрагментов со схожей или одинаковой длиной, так что конструкция праймеров для мультиплексной ПЦР может быть гибкой.

По сравнению с традиционным способом мультиплексного недиагностического тестирования настоящее изобретение имеет преимущество в том, что:

1. температура гибридизации усредняется посредством применения TAG-технологии, так что реакция гибридизации продуктов мультиплексной ПЦР патогенов может быть проведена при одной и той же температуре, тем самым улучшая производительность тестирования;

2. конструкция, которая вводит TAG-последовательность в 5'-конец прямого праймера, и мечение 5'-конца обратного праймера биотином в процессе синтеза праймера позволяют проводить реакцию гибридизации между микросферами и ПЦР-продуктами одновременно с реакцией между биотином и стрептавидин-фикоэритрином, что экономит время реакции и повышает эффективность тестирования;

3. введение вырожденных оснований позволяет диапазону тестирования не быть ограниченным определенным видом, или определенным пораженным болезнью или инфицированным растением, таким образом, система мультиплексного тестирования может применяться для тестирования видов.

Как показано на фигурах 1 и 2, настоящее изобретение предусматривает способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, который применяется для тестирования девятикратных ПЦР-продуктов вируса клещевого энцефалита, вируса синьцзянской геморрагической лихорадки, Rickettsiae группы пятнистой лихорадки, Babesia spp., Ehrlichia, Francisella tularensis, Rickettsia австралийской лихорадки Q, Borrelia burgdorferi и Bartonella, где способ включает следующие этапы:

1. определение диагностических фрагментов вышеупомянутых двенадцати вирусов, получение последовательности гена-кандидата из GenBank NCBI (Национальный центр биотехнологической информации США), разработка специфического праймера для тестирования с использованием программного обеспечения и синтез корреляционных праймерных последовательностей, где 5'-конец прямого праймера помечается Tag, связанной с праймером посредством С9 или С18 (имеющими одинаковый результат связывания); и мечение 5'-конца обратного праймера биотином с праймерной последовательностью, показанной в таблице 1, и разбавление этих праймеров до 10 мкмоль/л;

2. проведение амплификации вышеупомянутых девяти видов патогенов, тестируемых при помощи выполнения мультиплексной ПЦР с использованием вышеуказанных праймеров.

Всего тестировали 100 экземпляров собранных образцов клещей путем проведения общего моделирования; образец определяли как положительный, если измеренное значение флуоресценции было равным или в три раза выше фонового значения флуоресценции, при этом тестировали 1 экземпляр Rickettsia австралийской лихорадки Q и 2 экземпляра вируса клещевого энцефалита, что соответствует результатам в изолированной культуре и флуоресцентной количественной ПЦР, и таким образом все образцы были определены верно.

Захватывание и тестирование ПЦР-продукта, подвергаемого тестированию захватыванием зондом, проводили посредством следующих стадий:

i. добавляли 3500 микросфер каждого типа микросфер, имеющих метки анти-Tag, в раствор для гибридизации, так что общее содержание микросфер составляло 35 мкл, и затем вычисляли соответствующее количество для добавления согласно результатам подсчета микросфер;

ii. добавляли 5-17 мкл соответствующих ПЦР-продуктов патогенов, передающихся клещами, в соответствующие пробирки и затем производили равномерное перемешивание смеси многократным пипетированием;

iii. затем добавляли 4 нг/мкл SA-PE в 1 × растворе ТМАС в каждую лунку с получением общего объема 80 мкл;

iv. проводили гибридизацию в течение определенного времени при 37°С;

v. переносили гибридизированный продукт на пластину фильтра для фильтрации несвязанных ПЦР-продуктов путем всасывания и затем добавляли 80 мкл 1 × раствора ТЕ в каждую лунку и осциллировали для ресуспендирования микросфер;

vi. тестировали продукт на приборе после завершения реакции. Систему Bio-PlexTM применяли для тестирования, где численность микросфер определяли возбуждением красной флуоресценции в средах микросфер и количественный анализ связанных ПЦР-продуктов проводили при помощи возбуждения фикоэритрина на поверхности микросфер.

Количественное тестирование

Тестируемые целевые нуклеиновые кислоты серийно разводили согласно общим правилам с разведением более чем на 6 порядков и затем выполняли ПЦР разведенных последовательностей посредством вышеуказанного способа ПЦР и при вышеуказанных условиях реакции. Тестирование ПЦР-продуктов осуществляли, как описано выше, и уравнение, предусматриваемое системой анализа Bio-Plex версии 4.0, использовали для аппроксимации стандартной кривой, основанной на результатах тестирования, таким образом, количественного определения тестируемых образцов нуклеиновых кислот достигали только замещением значений MFI соответствующих тестируемых образцов согласно стандартной кривой.

Например, геном Borreia burgdorferi серийно разводили в 10 раз до 8 фг-800 нг, ПЦР-амплификацию и тестирование выполняли на разведенном геноме согласно разработанному способу и результаты тестирования аппроксимировали стандартной кривой, основанной на уравнении кривой: стандартная кривая: FI=-6,53652+(1881,23+6,53652) / ((1+(конц. / 14,9405)^-1,61702))^0,916998, при этом предел тестирования, рассчитанный по стандартной кривой, составлял 173 фг/пробу.

Анализ Результатов

Вместе с этим тестированием в качестве фона тестирования также проводили тестирование гибридизации негативных контролен ПЦР. Для каждой системы тестирования и каждого фона тестирования выходные данные, полученные с помощью прибора, представляли собой значение медианы интенсивности флуоресценции (MFI) идентичным образом подсчитанных микросфер в соответствующей реакционной системе, т.е. статистическое среднее значение интенсивностей сигналов микросферы, соответствующих идентичным образом подсчитанным микросферам (100 или более). Значения интенсивности флуоресценции (MFI) и фоновые значения MFI (BFI) соответствующих лунок считывали с помощью системы суспензионных микрочипов Bio-Plex.

Анализ результатов

Образец определяли как положительный, если значение MFI тестируемого образца превышало интенсивность фонового сигнала тестирования более чем в три раза.