Результат интеллектуальной деятельности: Способ очистки почвы от загрязнений нефтепродуктами

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться для очистки загрязненных углеводородами и экотоксикантами земель с использованием биопрепарата.

Биологический метод очистки почв заключается в направленной активизации почвенной микрофлоры, внесении микробных препаратов, разлагающих нефть, а также фиторемедиации - снижении загрязнения почвы, основанного на стимуляции естественного почвенного сообщества нефтеокисляющих микроорганизмов в результате их тесного взаимодействия с толерантными к нефти растениями.

Биопрепараты стимулируют местный почвенный биоценоз и создают благоприятные условия для перехода нефтяных углеводородов в трудноокисляемое состояние. Образуются органические соединения гумусоподобного характера, положительно влияющие на почвенное плодородие. Разложение нефти в почве обусловлено не только непосредственным действием живых микроорганизмов, входящих в состав биопрепаратов, но и способностью последних влиять на аборигенное микробное сообщество почвы, повышая его способность утилизировать нефть.

Известен способ биологической ремедиации нефтезагрязненных почв (патент РФ №2290270, В09С 1/10, опубл. 27.12.2006), заключающийся в том, что почву обрабатывают сухим бакпрепаратом с наполнителем. В качестве микроорганизмов используют штамм Pseudomonas fluorescens КО (ВНИИСХМ Д-619) и штамм Pseudomonas aeruginosa КОА-3 (ВНИИСХМ Д-609), а в качестве наполнителя используют отходы бурого угля. После обработки почвы ее засевают семенами смеси бобовых и злаковых культур, предварительно обработанных сухим регулятором роста растений, в качестве которого берут бакпрепараты на основе Azotobacter chroococcum Mut-1 (ВНИИСХМ В-35 Д), Bacillus megaterium КС-1 (ВНИИСХМ В-135 Д). Применение изобретения позволяет достичь устойчивого травостоя на почве после разложения нефтепродуктов. Недостаток данного способа заключается в том, что биопрепарат и регулятор роста растений используют в сухом виде, а, как известно, все микроорганизмы проявляют свою активность только в воде, поэтому эффективность известного способа невысока.

Известен наиболее близкий к предлагаемому (прототип) способ биоремедиации нефтезагрязненных почвогрунтов (патент РФ №2499636, В09С 1/10, опубл. 27.11.2013), включающий обработку грунтов бакпрепаратом на основе наполнителя и микроорганизмов. При этом в качестве наполнителя используют шлам обогащения обогатительной фабрики, а в качестве микроорганизмов используют культуры Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539. Шлам обогащения обогатительной фабрики и культуры Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 берут в соотношении 8:1,5: 0,5. Способ позволяет восстанавливать продуктивность деструктированных почв от нефти и нефтепродуктов с одновременной очисткой. Недостатком известного решения является использование в качестве нефтеокисляющих микроорганизмов культуры Pseudomonas fluorescens, обладающей низкой скоростью окисления углеводородов, а также внесение биопрепарата в почву в виде сухого вещества. Кроме того, расчет количества биопрепарата в зависимости от площади, а не от массы загрязнения, не позволяет учитывать глубину загрязнения, которая может быть различной.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является разработка способа с применением высокоэффективного биопрепарата для быстрой очистки загрязненных углеводородами земель, в т.ч. при низких положительных температурах.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является повышение эффективности очистки загрязненных углеводородами земель, а также расширение функциональных возможностей предлагаемого способа, заключающееся в возможности реализации технологии очистки при низких температурах.

Указанный технический результат достигается за счет того, что в способе очистки почвы от загрязнений нефтепродуктами, включающем обработку почвы биопрепаратом на основе микроорганизмов, загрязненную почву обрабатывают суспензией биопрепарата, в котором в качестве микроорганизмов используют культуры Microbacterium testaceum ВКПМ Ас-1998 и Alcaligenes faecalis ВКПМ В-12416, взятые в соотношении 1:1. В загрязненную почву вносят такое количество суспензии биопрепарата, в котором содержание культуры Alcaligenes faecalis ВКПМ В-12416 по абсолютно сухому веществу составляет 0,2% - 0,5% от массы загрязнителя.

Штаммы, используемые для получения биопрепарата в предлагаемом способе, получены селекционным путем из образцов проб грунта с Бованенковского НГКМ п/о Ямал.

Штамм бактерий Alcaligenes faecalis ВКПМ В-12416.

Способ размножения штамма - ферментация. Оптимальный состав минеральной среды для размножения штамма: K₂HPO₄ - 1,5 г/л, MgSO₄ - 1,5 г/л, пептон - 20,0 г/л, глицерин - 8 мл/л, вода дистиллированная, рН - 7,0, температура 30°С. Культивирование штамма проводили в колбах на круговых качалках при скорости вращения 220 об/мин в течение 48 ч.

Морфологические особенности штамма оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Клетки данного штамма представляют собой прямые подвижные палочки с закругленными концами, размером (0,4-0,5)×(1,7-2,5) мкм. Выделенный штамм образует колонии (на 5-ые сутки культивирования на L-агаре) круглые, шероховатые, матовые, с зубчатым краем, 3-5 мм, розового цвета, мягкие, хорошо суспендируемые в воде.

Штамм непатогенный и нетоксичный. Культура хранится в пробирках на скошенном L-агаре, пересев 2 раза в год, хранение при температуре 4°С.

Штамм бактерий Microbacterium testaceum ВКПМ Ас-1998.

Способ размножения штамма - ферментация. Оптимальный состав минеральной среды для размножения штамма: K₂HPO₄ - 0,5 г/л, КН₂РО₄ - 0,5 г/л, (NH₄)₂SO₄ - 0,5 г/л, MgSO₄ - 0,2 г/л, ZnSO₄ - 0,01 мг/л, СаСО₃ - 2,5 г/л, NaCl - 0,2 г/л, MoO₄ - 0,005 г/л, FeSO₄ - 12,5 мг/л, дрожжевой экстракт 1,0 г/л, вода водопроводная, глюкоза - 10 г/л, рН - 7,0-7,2, температура 25-35°С. Культивирование штамма проводили в колбах на круговых качалках при скорости вращения 220 об/мин в течение 48-72 ч.

Морфологические особенности штамма оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Клетки данного штамма на твердых питательных безазотистых средах образуют крупные беловатые слизистые колонии, которые с возрастом буреют. Клетки в молодых (односуточных) культурах в основном палочковидные, размером (1,5-2,0)×(3,0-7,0) мкм, подвижные, склонные к резко выраженному полиморфизму (от палочковидных до кокковидных).

Штамм непатогенный и нетоксичный. Культура хранится в пробирках на скошенном агаре (дрожжевой экстракт - 3%, агар-агар - 2%, вода водопроводная), пересев 2 раза в год, хранение при температуре 4°С.

Штаммы депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика.

Преимуществом предлагаемого способа является использование штаммов, адаптированных к холоду, обладающих достаточной активностью при низких температурах, что позволяет реализовать данный способ при низких положительных температурах, в т.ч. для очистки нефтезаргязненных территорий в районах Севера и Западной Сибири. Полученный в процессе селекции ризосферный штамм культуры Alcaligenes faecalis ВКПМ В-12416 обладает удельной скоростью потребления углеводородов не менее 0,8 кг в сутки на 1 кг биомассы культуры (по сухому веществу) при пониженных температурах, что подтверждено лабораторными и полевыми испытаниями.

Способ осуществляют следующим образом.

Культуры штаммов Microbacterium testaceum ВКПМ Ас-1998 и Alcaligenes faecalis ВКПМ В-12416, входящих в состав биопрепарата, выращивают раздельно на жидкой питательной среде. Затем приготавливают суспензию биопрепарата из биомассы выращенных культур, взятых в соотношении 1:1. Расчетным путем (с учетом площади и глубины загрязнения, плотности загрязненной почвы, а также концентрации загрязнителя) определяют массу загрязнителя в почве. Необходимое для внесения в загрязненную почву количество суспензии биопрепарата рассчитывают таким образом, чтобы содержание культуры Alcaligenes faecalis ВКПМ В-12416 по абсолютно сухому веществу (АСВ) в суспензии составляло 0,2%-0,5% от массы загрязнителя. Содержание культуры Alcaligenes faecalis ВКПМ В-12416 (сухого вещества) в суспензии определяют фотоколориметрическим методом или методом высушивания. Затем необходимое количество суспензии биопрепарата вносят в очищаемую почву.

Ниже приводятся примеры, подтверждающие высокую эффективность предлагаемого способа.

Пример 1

Для проведения эксперимента была выбрана загрязненная моторным топливом земля в Московской области без растительного покрова. Общая площадь загрязнения составила около 60 м,² глубина загрязнения была одинакова на всей площади и составляла около 5 см. Был проведен анализ земли для определения плотности почвы и концентрации нефтепродуктов в почве на этом участке. При помощи весового метода определили, что плотность почвы составляет 1,6×10³ кг/м³. Концентрацию нефтепродуктов определяли методом ИК-спектрометрии, который показал концентрацию нефтепродуктов в почве 3%. На выбранном участке выделили 9 ячеек размером 1 м×1 м: 8 - для обработки биопрепаратом и одна контрольная ячейка, которая биопрепаратом не обрабатывалась. Далее, на основании полученных данных, определили содержание нефтепродуктов (массу загрязнителя) в каждой ячейке, которое составило 2,4 кг. Предварительно культуры штаммов Microbacterium testaceum ВКПМ Ас-1998 и Alcaligenes faecalis ВКПМ В-12416, входящие в состав биопрепарата, вырастили раздельно на жидкой питательной среде. Концентрация микроорганизмов по АСВ каждой из культур в культуральной жидкости составила 2% (20 г/л). Биопрепарат приготовили таким образом, чтобы культуры микроорганизмов Microbacterium testaceum ВКПМ Ас-1998 и Alcaligenes faecalis ВКПМ В-12416 входили в него в соотношении 1:1. Концентрация микроорганизмов (по АСВ) Alcaligenes faecalis ВКПМ В-12416 в готовой для обработки почвы суспензии биопрепарата составила 1% или 10 г/л. В каждую из восьми загрязненных ячеек внесли суспензию биопрепарата в количестве, мл: 120, 240, 480, 720, 960, 1200, 1680 и 2400, что соответствовало количеству микроорганизмов Alcaligenes faecalis ВКПМ В-12416 (по АСВ), %: 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,7 и 1,0 от массы загрязнителя. Проводили перемешивание на всю глубину загрязненной почвы. Полив производили по мере необходимости. Каждые 5 дней брали образцы почвы из каждой ячейки для определения концентрации углеводородов. Определение концентрации углеводородов в почве проводили методом ИК-спектрометрии.

По результатам эксперимента очевидно, что оптимальное количество суспензии биопрепарата для обработки загрязненной почвы составляет от 480 мл до 1200 мл (через 30 суток - степень очистки от 80% до 84%), что соответствует оптимальному количеству культуры Alcaligenes faecalis ВКПМ В-12416 (по АСВ) в интервале от 0,2% до 0,5% от массы загрязнителя. Дальнейшее увеличение степени очистки приводит к неоправданно высокому расходу биопрепарата.

Результаты эксперимента представлены в таблице 1.

Пример 2

На территории бывшего автотранспортного предприятия Бованенковского НГКМ п/о Ямал был найден участок земли размером около 20 м², загрязненный дизельным топливом. После оттаивания земли на глубину 10 см отобрали образцы грунта для определения содержания углеводородов по всей поверхности участка и на всю глубину оттаивания (были отобраны образцы в 9 точках на площади загрязнения и в каждой точке по четыре образца с разных глубин с интервалом 3 см). Результаты анализов показали, что средняя глубина загрязнения составляет 4,5 см, а средняя концентрация загрязнителя по всем точкам отбора - 2,3%. Определение концентрации углеводородов в почве проводили методом ИК-спектрометрии. Почва на участке суглинистая. Плотность почвы определяли весовым способом, результаты показали, что плотность в данном месте составляет около 1650 кг/м³. На выбранном участке были разбиты 6 ячеек размером 1 м × 1 м для обработки биопрепаратом и одна контрольная ячейка такого же размера, которая биопрепаратом не обрабатывалась. Общее содержание нефтепродуктов в каждой ячейке, определенное как в примере 1, составило 1,7 кг. Суспензию культур Microbacterium testaceum ВКПМ Ас-1998 и Alcaligenes faecalis ВКПМ В-12416 для обработки почвы готовили аналогично примеру 1. Обработку проводили после оттаивания почвы на глубину 50 см, при этом температура почвы на глубине 4 см составляла 6°С. В каждую из шести ячеек внесли суспензию биопрепарата в количестве, мл: 170, 340, 510, 680, 850 и 1020 мл, что соответствовало содержанию микроорганизмов Alcaligenes faecalis ВКПМ В-12416 (по АСВ), %: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 и 0,6 от массы загрязнителя. Проводили перемешивание на всю глубину загрязненного грунта. Полив производили по мере необходимости. Каждые 5 дней брали образцы почвы из каждой ячейки для определения концентрации углеводородов. В течение 30 дней температура почвы колебалась от 6°С до 11,5°С, средняя температура составила 8,1°С. Определение концентрации углеводородов в почве проводили методом ИК-спектрометрии.

Результаты эксперимента подтверждают достаточно высокую степень очистки (через 30 суток - от 55% до 65%) при реализации предлагаемого способа в условиях низких положительных температур.

Полученные данные представлены в таблице 2.

Таким образом, реализация предлагаемого способа обеспечивает повышение эффективности очистки нефтезагрязненной почвы за счет внесения биопрепарата в очищаемую почву в виде суспензии, в которой количество нефтеокисляющих микроорганизмов рассчитывают в зависимости от массы загрязнителя, что позволяет обеспечить предварительную активацию микроорганизмов, равномерное внесение микроорганизмов по всей площади загрязнения и проникновение микроорганизмов на всю глубину загрязнения. Кроме того, использование штаммов, обладающих достаточной активностью при низких положительных температурах, позволяет эффективно очищать загрязненные почвы в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур.