УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА ГИНКГО БИЛОБА

Настоящее изобретение относится к усовершенствованному многостадийному способу получения экстракта листьев гинкго билоба для применения в качестве лекарственного средства.

Экстракты листьев гинкго билоба веками применяли в качестве лекарственных средств. В настоящее время они используются для лечения различных видов деменции и ее симптомов и нарушений церебрального и периферического кровообращения. Ингредиенты, обусловливающие активность, представляют собой терпеновые лактоны (гинкголиды A, B, C и билобалид) и флавонгликозиды (кверцетин, кемпферол и изорамнетин). Согласно современному определению по Европейской фармакопее (версия 8.0; статья 04/2008: 1827 "Ginkgo dry extract, refined and quantified"), которое объединяет все экстракты гинкго, но может быть одобрено в качестве лекарственных средств в контексте фармакопеи, экстракт гинкго содержит от 22.0% до 27.0% флавоноидов в расчете на флавонгликозиды, от 2.6% до 3.2% билобалида, от 2.8% до 3.4% гинкголидов A, B и C и не более 5 ppm (м.д., млн^-1) гинкголевых кислот. Его приготовление описано в публикации "Bekanntmachung die Zulassung und Registrierung von Arzneimittel (Aufbereitungsmonographien den humanmedizinischen Bereich) - Ginkgo folium (Ginkgo-biloba-)" ("Уведомление об одобрении и регистрации лекарственных средств (статьи о приготовлении медицинского препарата для человека) - Ginkgo folium (листья гинкго билоба)") (Bundesanzeiger 46, (133), 7360-7361 (1994)): "A dry extract prepared from the dried leaves of Ginkgo biloba LINNE with acetone-water and subsequent purification steps without the addition of concentrates or isolated ingredients" ("Сухой экстракт, приготовленный из высушенных листьев гинкго билоба LINNE с применением системы ацетон-вода и с последующими стадиями очистки, без добавления концентратов или отдельных ингредиентов").

В последнее время получают листья гинкго билоба со все более высоким содержанием ингредиентов, но экстракция этих ингредиентов известным способом не дает экстракты, соответствующие требованиям Европейской фармакопеи. В частности, в настоящее время собирают листья гинкго с необычайно высоким содержанием терпеновых лактонов, которые, соответственно, дают экстракты с повышенным содержанием этих лактонов. Однако иногда лисья гинкго содержат также большое количество флавоноидов.

Предпочтительные способы экстракции, в результате которых получают экстракты в соответствии с требованием Европейской фармакопеи (Ph. Eur.) при использовании надлежащих листьев гинкго, описаны в Европейских патентах ЕР 431535 B1 (Dr. Willmar Schwabe GmbH & Co.) и ЕР 360556 B1 (Indena S.p.A.). В последнее время способ в соответствии с ЕР 431536 B1 (Dr. Willmar Schwabe GmbH & Co.) стал более предпочтительным, поскольку в этом способе не требуются опасные с точки зрения токсикологии соединения, например, такие как соли свинца (ЕР 431535 B1) или ароматические углеводороды (ЕР 360556 В1).

Согласно п.1 Европейского патента ЕР 431536 B1 заявленный способ получения экстракта листьев гинкго билоба включает следующие стадии:

(а) свежие или высушенные зеленые листья гинкго билоба экстрагируют водой, содержащей ацетон, водой, содержащей алканол (предельный алифатический алканол), включающий от 1 до 3 атомов C, или безводным метанолом при температуре примерно от 40 до 100°C,

(б) из экстракта удаляют основное количество органического растворителя с тем, чтобы его содержание в экстракте было не более 10% вес., при этом на последних стадиях перегонки при необходимости добавляют воду,

(в) к оставшемуся концентрированному водному раствору прибавляют воду, доводя содержание твердых веществ до 5-25% вес., охлаждают при перемешивании до температуры ниже 25°C, оставляют осаждаться и выпавший осадок, состоящий из липофильных компонентов, плохо растворимых в воде, отделяют,

(г) к оставшемуся водному раствору добавляют сульфат аммония и полученный раствор экстрагируют метилэтилкетоном или смесью метилэтилкетона и ацетона,

(д) полученный экстракт концентрируют, доводя содержание твердых веществ до 50-70%, и к полученному концентрату добавляют воду до получения содержания твердых веществ 5-20%,

(е) полученный таким образом раствор несколько раз (в несколько стадий) экстрагируют бутанолом или пентанолом, не смешивающимся с водой,

(ж) бутанольную и пентанольную фазы (вытяжки), соответственно, концентрируют до содержания твердых веществ 50-70%,

(з) концентрат разводят, добавляя такое количество воды и этанола, чтобы получить раствор с содержанием сухого экстракта 5-20% вес. в 20-60% вес. в водном этаноле,

(и) водно-алканоловой раствор экстрагируют алифатическим или циклоалифатическим растворителем с температурой кипения от 60 до 100°C для дополнительного отделения алкилфенольных соединений,

(к) водную фазу упаривают в вакууме и сушат при температуре не выше 60-80°C, получая сухой экстракт с содержанием воды менее 5%.

Целью настоящего изобретения является предоставление усовершенствованного способа получения экстракта листьев гинкго билоба, который соответствует требованиям Европейской фармакопеи, даже если используются листья гинкго с неблагоприятным составом ингредиентов, в частности, с повышенным содержанием терпеновых лактонов, но также с повышенным содержанием флавоноидов. Также целью настоящего изобретения является осуществление способа таким образом, чтобы не добавлять чистые соединения или почти чистые концентраты, так как это не допускается для экстрактов гинкго, применяемых в качестве лекарственных средств.

Неожиданно было обнаружено, что, используя дополнительные стадии в способе согласно Европейскому патенту EP 431536 В1, из листьев гинкго с неблагоприятным составом ингредиентов также можно получить экстракты в соответствии с требованием Европейской фармакопеи. Для этой цели после экстракции (жидкость-жидкостного распределения) в соответствии со стадией (г) водную фазу (водный слой) отделяют от фазы, содержащей метилэтилкетон и метилэтилкетон-ацетон, соответственно, фазу, содержащую метилэтилкетон и метилэтилкетон-ацетон, соответственно, концентрируют (упаривают) до содержания сухого экстракта от 40 до 80% вес., получая концентрат. Часть, от 10 до 60% вес., концентрата водой и метилэтилкетоном доводят до содержания сухого экстракта не более 60% вес. и содержания метилэтилкетона не более 30% вес., и экстрагируют смесью метилэтилкетона и алифатического растворителя с температурой кипения от 60 до 100°С в соотношении от 7/3 до 9/1 (моль/моль), получают фазу (слой), содержащую воду и метилэтилкетон, и фазу, содержащую метилэтилкетон и алифатический растворитель.

Фазу, содержащую воду и метилэтилкетон, объединяют с остальной частью, 90-40% вес., концентрата, получая раствор и при этом предотвращая слишком высокое содержание терпеновых лактонов в конечном продукте.

Или же полученную фазу, содержащую метилэтилкетон и алифатический растворитель, можно объединять с оставшейся частью, 90-40% вес., концентрата для предотвращения слишком высокого содержания флавоноидов в конечном продукте.

Таким образом, способ получения сухого экстракта листьев гинкго билоба, содержащего от 22.0% вес. до 27.0% вес. флавоноидов, в расчете на флавонгликозиды, от 2.6% вес. до 3.2% вес. билобалида, от 2.8% вес. до 3.4% вес. гинкголидов A, B и C и не более 5 ppm (м.д.) гинкголевых кислот, включает следующие стадии:

(а) экстракция свежих или высушенных зеленых листьев гинкго билоба водой, содержащей ацетон, водным алканолом, содержащим от 1 до 3 атомов C, или безводным метанолом при температуре примерно от 40 до 100°C с получением неочищенного раствора экстракта,

(б) удаление (отгонка) из неочищенного раствора экстракта, полученного на стадии (а), основного количества ацетона или алканола (предельного алифатического алканола), содержащего 1-3 атома C, с тем, чтобы его содержание в экстракте было не более 10% вес., при этом, если на стадии (а) применяют безводный метанол, то на последних стадиях перегонки добавляют воду для получения концентрированного водного раствора,

(в) разбавление концентрированного водного раствора, полученного на стадии (б), водой до содержания твердых веществ до 5-25% вес., охлаждение до температуры ниже 25°C, выдерживание на холоду до выпадения осадка и отделение образовавшегося осадка с повторным получением водного раствора,

(г) добавление сульфата аммония к полученному на стадии (в) водному раствору и экстракция образовавшегося раствора, содержащего сульфат аммония, метилэтилкетоном или смесью метилэтилкетона и ацетона, отделение водной фазы от фазы, содержащей метилэтилкетон, или фазы, содержащей метилэтилкетон-ацетон, с получением фазы, содержащей метилэтилкетон, или фазы, содержащей метилэтилкетон и ацетон,

(д) концентрирование фазы, содержащей метилэтилкетон или метилэтилкетон-ацетон, полученной на стадии (г), с целью получения концентрата, содержание сухого экстракта в котором составляет 40-80% вес.,

(е) добавление к порции концентрата, полученного на стадии (д), составляющей от 10 до 60% вес., воды и метилэтилкетона таким образом, чтобы доля сухого экстракта составляла не более 60% вес., а содержание метилэтилкетона было не более 30% вес., получение при этом скорректированного экстракционного раствора и экстракция полученного скорректированного экстракционного раствора смесью метилэтилкетона и алифатического растворителя с температурой кипения от 60°C до 100°C в соотношении от 7/3 до 9/1 (моль/моль) и образование при этом фазы, содержащей воду и метилэтилкетон, и фазы, содержащей метилэтилкетон и алифатический растворитель,

(ж) объединение оставшейся части, 90 до 40% вес., концентрата со стадии (д) с фазой, содержащей воду и метилэтилкетон со стадии (е), или с фазой, содержащей метилэтилкетон и алифатический растворитель со стадии (е), и получение раствора,

(з) концентрирование раствора со стадии (ж) до содержания твердых веществ от 50 до 70% вес. и разбавление полученного концентрата водой до получения раствора с содержанием твердых веществ не более 50% вес.,

(и) многостадийная экстракция раствора, полученного на стадии (з), бутанолом или пентанолом, не смешивающимся с водой, и получение бутанольной или пентанольной фазы,

(к) концентрирование бутанольной или пентанольной фазы со стадии (и) с целью получения концентрата с содержанием твердых веществ по меньшей мере 50%,

(л) разбавление концентрата, полученного на стадии (к), посредством добавления, при необходимости, таких количеств воды и этанола, чтобы получить раствор, содержащий от 5 до 20% сухого экстракта в воде или не более чем в 60%-ном (вес) водном этаноле,

(м) экстракция водного или водно-этанольного раствора со стадии (л) алифатическим растворителем с температурой кипения от 60 до 100°C, получение водной фазы посредством отделения ее от фазы, содержащей алифатический растворитель,

(н) концентрирование водной фазы, полученной на стадии (м), в вакууме и при температуре не выше 60-80°C и получение сухого экстракта с содержанием воды менее 5% вес.

Согласно предпочтительным вариантам изобретения:

- в качестве растворителя для экстракции на стадии (а) используют воду, содержащую ацетон, с содержанием ацетона от примерно 50 до 70% вес., причем предпочтительно с содержанием ацетона примерно 60% вес.,

- в качестве растворителя для экстракции на стадии (а) используют воду, содержащую алканол (предельный алифатический алканол), выбранный из метанола, 1-пропанола и 2-пропанола, с содержанием алканола от примерно 50% вес. до 70% вес., при этом особенно предпочтительным является водный этанол с содержанием этанола примерно 60% вес.,

- на стадии (в) разбавленный активный раствор охлаждают до температуры ниже 12°C,

- на стадии (г) добавляют по меньшей мере 30% вес. сульфата аммония, особенно предпочтительно от 30 до 50% вес. сульфата аммония в расчете на водный раствор, полученный на стадии (в),

- на стадии (г) экстрагируют смесью метилэтилкетона и ацетона в соотношении от 7/3 до 3/4 (моль/моль),

- на стадии (и) экстрагируют 1 -бутанолом и/или

- на стадии (к) экстрагируют гептаном, при этом особенно предпочтительным является н-гептан или смесь изомеров гептана, содержащая более 35% вес. н-гептана.

Кроме того, по аналогии с Европейскими патентами EP 1868625 В1 и EP 1868568 В1, для удаления 4'-O-метилпиридоксина можно осуществлять следующие дополнительные стадии:

(о) приготовление водно-этанольного раствора экстракта гинкго с содержанием этанола от 40% вес. до 60% вес. при использовании водной фазы со стадии (л) или сухого экстракта со стадии (н),

(п) нанесение водно-этанольного раствора экстракта гинкго со стадии (о) на сильнокислотную ионообменную смолу для удаления 4'-O-метилпиридоксина, который остается на ионообменной смоле, и элюирование водным этанолом с получением, в виде элюата, экстракционного раствора, не содержащего 4'-O-метилпиридоксина,

(р) концентрирование элюата со стадии (п) в вакууме и сушка при температуре не выше 60-80°C до получения сухого экстракта с содержанием воды менее 5% вес.

Примерами сильнокислотных ионообменных смол являют ионообменные смолы Merck I и Amberlite (Амберлайт) IR-120. Обычно сильнокислотная ионообменная смола представляет собой полистирольную смолу, с которой связаны сульфокислотные группы.

Ниже даются определения некоторых терминов, относящихся к способу по изобретению:

Сухой экстракт: в соответствии с требованием Европейской фармакопеи содержание воды в сухих экстрактах, как правило, составляет не более 5% вес.

Определение "безводный", например, по отношению к безводному метанолу на стадии (а) по настоящему изобретению указывает на содержание воды ≤1% вес.

Экстракция представляет собой однократную (одностадийную), многократную (многостадийную) или непрерывную экстракцию.

Алифатические растворители с температурой кипения от 60 до 100°C предпочтительно представляют собой н-гептан или смеси насыщенных ациклических и/или циклических алифатических углеводородов, которые характеризуются температурой кипения и известны и коммерчески доступны под названием петролейный (нефтяной) эфир или бензин. Предпочтительно применяют смесь алифатических углеводородов, состоящую по существу из н-гептана и других С7 алканов. Высокое содержание, более 35% вес., н-гептана (температура кипения 98°C) обнаружено, например, во фракции 94-100°C.

Бутанол или пентанол, не смешивающийся с водой, указанный на стадии (и), обозначает предпочтительно 1-бутанол или 1-пентанол.

Далее способ по изобретению объясняется и описывается более подробно на Сравнительном Примере 1 согласно Европейскому патенту ЕР 431 536 В1 и на Примере 1 по изобретению.

Исходный раствор для Примера 1 и Сравнительного Примера 1

(в соответствии со стадиями от (а) до (г) Европейского патента EP 431536 B1 и способа по настоящему изобретению)

В нижеприведенных примерах термин "гептан" обозначает смесь насыщенных ароматических углеводородов с температурой кипения в интервале 94-100°C и содержанием н-гептана выше 35% вес.

500 г высушенных и измельченных листьев гинкго билоба экстрагировали с использованием 3.75 кг 60% вес. ацетона в течение 30 мин при 60°C. Растительный материал отфильтровывали, снова экстрагировали с использованием 3.75 кг 60% вес. ацетона в течение 30 мин при 60°C и снова отфильтровывали. Полученные при этом два экстракционных раствора объединяли и концентрировали (438 г; содержание (доля) сухого экстракта 36.9%).

К полученному концентрату добавляли 400 г воды и перемешивали 1 час при 12°C. Выпавший осадок отфильтровывали и к фильтрату добавляли 240 г сульфата аммония и растворяли его. Этот раствор дважды экстрагировали смесью метилэтилкетон/ацетон 6/5 (моль/моль) (400 мл×2). Фазы (вытяжки смесью растворителей)) метилэтилкетон/ацетон объединяли (808 г).

Сравнительный пример 1 в соответствии с патентом EP 431536 B1

(стадии от (д) до (к) согласно описанному способу)

Половину указанного выше исходного раствора (404 г) концентрировали до получения 27.2 г); часть сухого экстракта составила 50%. Этот концентрат разбавляли водой 107.8 г воды (часть сухого экстракта составила 10%) и обрабатывали при встряхивании три раза, используя каждый раз 65 мл 1-бутанола, насыщенного водой. Фазы, содержащие 1-бутанол, соединяли, концентрировали и высушивали в вакууме в течение 16 ч при температуре 50°C (6.72 г).

Полученный таким образом сухой экстракт растворяли в смеси 20.2 г этанола и 40.3 г воды (часть сухого экстракта составила 10%). Полученный раствор экстрагировали при встряхивании три раза, используя каждый раз 20 мл гептана, концентрировали и сушили в вакууме в течение 16 ч при температуре 50°C: 6.11 г (2.4% в расчете на лекарство).

Полученный таким образом экстракт не отвечает требованиям, предъявляемым Европейской фармакопеей в отношении содержания билобалида и гинкголидов A, B и C.

Пример 1 в соответствии с настоящим изобретением

(стадии от (д) до (н) по изобретению)

Вторую половину описанного выше исходного раствора (404 г) концентрировали (до 20.5 г; часть сухого экстракта составила 68.2%). К 10.75 г полученного концентрата добавляли 8.1 г воды и 5.6 г метилэтилкетона до получения части сухого экстракта, составляющей 30% и до содержания метилэтилкетона равного 23% по весу, и экстрагировали два раза при встряхивании, используя каждый раз 18.3 г смеси метилэтилкетон/гептан 8/2 (моль/моль).

Фазу, содержащую воду-метилэтилкетон соединяли с остальной частью концентрата исходного раствора (9.75 г). Этот раствор концентрировали до получения 24.17 г, добавляли 115.5 г воды до получения части сухого экстракта, составляющей 10% и экстрагировали три раза при встряхивании, используя каждый раз 65 мл 1-бутанола, насыщенного водой. Фазы, содержащие 1-бутанол, соединяли, концентрировали и высушивали в вакууме в течение 16 ч при температуре 50°C (5.93 г).

Полученный таким образом экстракт растворяли в смеси 17.8 г этанола и 35.6 г воды (часть сухого экстракта составила 10%). Этот раствор экстрагировали три раза при встряхивании, используя каждый раз 20 мл гептана, концентрировали и высушивали в вакууме в течение 16 ч при температуре 50°C: 5.29 г (2.1% в расчете на лекарство).

Полученный таким образом экстракт удовлетворяет всем требованиям Европейской фармакопеи в отношении содержания всех компонентов, в частности, содержания билобалида и гинкголидов A, B и C.