СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ГЕПАРИНА

Изобретение относится к технологии получения фармацевтической субстанции низкомолекулярного гепарина (НМГ), такого как надропарин, и может быть использовано для производства лекарственных препаратов на его основе.

Гепарин представляет собой антикоагулянт прямого действия, который синтезируется тучными клетками, являющимися разновидностью клеточных элементов соединительной ткани. В связи с этим, важнейшим источником для получения гепарина в фармакологических и медицинских целях является ткань легких и печени животных методом протеолиза или деполимеризации с последующей очисткой гепарина-сырца.

Гепарин является линейным гетерополисахаридом, построенным из чередующихся остатков α-D-глюкопиранозилуроновой(глюкуроновой)кислоты и 2-сульфамино-2-дезокси-α-D-глюкопиранозы(сульфатированного N-ацетилглюкозамина), связанных α-1,4-гликозидными связями. Кроме сульфатных групп, гепарин содержит и сульфоэфирные группы (при C₆остатков сульфо-N-глюкозамина и, частично, при С₂глюкуроновой кислоты).

Для медицинских целей получают два типа гепарина: высокомолекулярный (ВМГ) и низкомолекулярный (НМГ) гепарины.

В настоящее время широкое применение получили препараты низкомолекулярного гепарина (НМГ), которые имеют достаточно высокую активность по фактору антикоагулянтной активности анти-Ха и низкую по анти-IIа активности (1).

В частности, используются препараты на основе субстанций дальтепарина, тинзапарина и эноксапарина натрия, надропарина, которые отличаются высокой антикоагуляционной активностью и имеют наиболее широкий спектр показаний.

В частности, примером получения эноксипарина натрия является способ получения низкомолекулярного гепарина, включающий стадии получения бензетониевой соли гепарина, бензилирования этой соли в неводном растворителе, спиртового осаждения неполного бензилового эфира бензетониевой соли гепарина и щелочной деполимеризации этого продукта, при которой бензетониевую соль нефракционированного гепарина получают в 0,05-0,5 М водном растворе натрия хлорида при температуре 50-60°С, рН=8,2-8,8 и массовом соотношении гепарин/бензетоний хлорид 1/(2,35-2,70), бензилирование бензетониевой соли гепарина проводят в течение 2-3 часов в среде биполярного апротонного растворителя бензилхлоридом в соотношении гепаринат/бензилхлорид 1/(0,2-1,0), который предварительно подвергают активированию в апротонном растворителе в течение 15-20 мин, осаждение бензилового эфира гепарина проводят методом Спиро этиловым спиртом, предварительно насыщенным безводным натрия ацетатом, с последующим снятием защиты с сульфогрупп, проведение β-элиминирования бензилового эфира со степенью этерификации гепарина 9-13% 1±0,5 N щелочью NaOH при температуре 55±5°С, длительности процесса 40-60 мин и массовым соотношении реагентов бензиловый эфир/щелочь 1/(0,5-2) (2).

Данный способ иллюстрирует общие черты получения фракций НМГ, а именно процесс деполимеризации ВМГ с последующим осаждением и фильтрацией. В результате получаются полидисперсные фрагменты полимерных макромолекул исходного гепарина более низкой молекулярной массы, в среднем 2000-10000 Да, при этом они отличаются молекулярной массой и молекулярно-массовым распределением, строением концевых групп, активностью относительно минорных факторов свертывания крови и их соотношением.

Одним из таких препаратов на основе НМГ является надропарин.

Используемый в качестве лекарственного препарата надропарин представляет собой кальциевую соль деполимеризованного гепарина с молекулярной массой от 4000 до 5000.

Он обладает прямым антикоагуляционным действием, анти-Ха и анти-IIа активностью, непосредственно влияет на находящиеся в крови факторы свертывания. Усиливает блокирующий эффект антитромбина III на фактор Ха (активирует переход протромбина в тромбин). Анти-Ха активность приблизительно в 4 раза превосходит анти-IIа активность. Обладает противовоспалительными и иммуносупрессивными (подавляет кооперативное взаимодействие Т- и В-клеток) свойствами, незначительно понижает уровень холестерина и бета-липопротеидов в сыворотке крови. Улучшает коронарный кровоток.

Применяется при тромбозах глубоких вен, тромбоэмболии легочной артерии, остром коронарном синдроме, нестабильной стенокардии, инфаркте миокарда, при острой дыхательной и сердечной недостаточности, а также с целью профилактики тромбозов у больных с высоким риском тромбообразования при ортопедических, онкологических и общехирургических операциях, при гемодиализе и гемофильтрации у больных с хронической почечной недостаточностью. Вводят в подкожную клетчатку живота (игла располагается перпендикулярно кожной складке).

Известно несколько способов получения надропарина.

Так, известен способ получения надропарина, включающий деполимеризацию гепарина с получением НМГ. Далее проводят процесс очистки, в котором выполняется устранение нитрозных групп путем нагревания водного раствора, содержащего низкомолекулярный гепарин при рН, составляющем от 3,0 до 13,0 при температуре, составляющей от 40 до 90°С; в течение времени от 15 минут до 180 минут, или путем обработки водного раствора, содержащего низкомолекулярный гепарин, излучением с помощью микроволн с частотой, находящейся между 900 и 2450 МГц при мощности 600-1000 Вт, в течение периода времени между 30 и 300 секундами (3).

Также известен способ получения гепарина низкомолекулярной массы нитрозной деполимеризацией гепарина природного происхождения, при котором водный раствор натриевой соли гепарина природного происхождения концентрацией 5-15 мас./об. % обрабатывают раствором нитрита щелочного металла из расчета 1,5-6,9 мас. % нитрита по отношению к взятой соли гепарина в присутствии соляной кислоты при рН 1-5 в течение 20-50 мин, при этом реакцию проводят до появления отрицательного теста на нитроионы, полученный продукт восстанавливают добавлением борогидрида натрия в количестве 0,5-2,0 мас. % от количества взятой соли гепарина, избыток которого разрушают соляной кислотой, полученную реакционную среду нейтрализуют и осаждают из нее этанолом гепарин низкомолекулярной массы в виде натриевой соли, водный раствор которой обрабатывают ультрафиолетовыми лучами с длиной волны от 180 до 350 нм при температуре 5-50°С и при рН 3-8 с получением гепарина низкомолекулярной массы, содержащего нитрозосоединения в количестве, менее или равном 5⋅10^-7 мг на мг продукта, или при рН 7 с направлением обработанного раствора на анионообменную колонку, которую промывают водой при рН приблизительно 7, и рекуперируют конечный продукт осаждением с хлористым натрием и этанолом с получением гепарина низкомолекулярной массы, содержащего нитрозосоединения в количестве, менее или равном 5⋅10^-8 мг на мг продукта (4).

Наиболее близким аналогом предлагаемого нами способа является способ получения надропарина кальция, где к гепарину, растворенному в воде, приливают ледяную уксусную кислоту для доведения величины рН до 2-6, после чего добавляют нитрит натрия при 20-30° и выдерживают 4-6 часов, далее раствор доводят до рН 8-12 с помощью гидроксида натрия, и к раствору добавляют борогидрид натрия и выдерживают 4-16 часов, затем доводят рН до 4-8 с помощью ледяной уксусной кислоты, в полученный раствор добавляют раствор кальция хлорида и осаждают его этанолом, осадок разводят водой, фильтруют и полученный фильтрат стерилизуют, подвергают сублимационной сушке, чтобы получить надропарин кальция (5).

Однако общим недостатком данных способов получения является то, что проведение процессов в таких условиях сопровождается избыточной деполимеризацией и в результате доля низкомолекулярной фракции (меньше 2000 Да) становится более 15%. Это ведет к снижению выхода целевого продукта, его качества и дополнительным затратам на его изготовление.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка такого способа получения надропарина, который бы позволил увеличить выход целевого продукта за счет снижения доли низкомолекулярной фракции.

Способ заключается в следующем: гепарин растворяют в воде, добавляют нитрит натрия и доводят рН раствора до 2-3 путем добавления соляной кислоты, выдерживают раствор до исчезновения нитрита и затем доводят рН раствора до 9-11 путем добавления гидроксида натрия, после чего в раствор вводят борогидрид натрия, реакционную смесь перемешивают несколько часов, избыток борогидрида натрия разрушают соляной кислотой, а полученную реакционную среду нейтрализуют, после чего осуществляют осаждение, для чего добавляют этанол и выдерживают несколько часов, отделяют выделившийся продукт центрифугированием, к супернатанту добавляют спирт, перемешивают несколько часов, получившийся первый продукт отфильтровывают, промывают спиртом и сушат, после чего осадок опять растворяют в воде, добавляют нитрит натрия и доводят рН раствора до 2-3 путем обработки соляной кислотой, выдерживают раствор до исчезновения нитрита и затем доводят рН раствора до 9-11 путем добавления гидроксида натрия, после чего в раствор вводят борогидрид натрия, реакционную смесь перемешивают несколько часов, избыток борогидрида натрия разрушают соляной кислотой, а полученную реакционную среду нейтрализуют, после чего осуществляют осаждение, для чего добавляют этанол и выдерживают несколько часов, отделяют выделившийся продукт центрифугированием, к супернатанту добавляют спирт, перемешивают несколько часов, получившийся второй продукт отфильтровывают, промывают спиртом и сушат, затем первый и второй сухой продукт растворяют в воде, пропускают через сильнокислый катионит, элюат доводят раствором гидроксида кальция до рН 6,6-7,2, фильтруют и лиофилизируют.

Заявляемый способ получения надропарина характеризуется тем, что осаждение проводят в водно-спиртовой среде с массовым соотношением вода:спирт от 1:0.2 до 1:2.

Заявляемый способ получения надропарина характеризуется тем, что осаждение из супернатанта проводят в водно-спиртовой среде с массовым соотношением вода:спирт от 1:2 до 1:4.

Очевидно, что надропарин кальция, полученный заявляемым способом, пригоден для лечения заболеваний, требующих введения антикоагулянтов.

Преимуществами способа (техническими результатами) является то, что:

- наш способ позволяет вести деполимеризацию в таких условиях, при которых низкомолекулярная фракция (менее 2000 Да) образуется в минимальном количестве (не более 15% от суммы двух фракций 2000-8000 Да и менее 2000 Да);

- последующее отделение избытка высокомолекулярной фракции (более 8000 Да) дробным водно-спиртовым осаждением, центрифугированием и спиртовым осаждением из супернантата позволяет получить целевое вещество с необходимым соотношением фракций;

- проведение деполимеризации гепарина в условиях, позволяющих получать количество низкомолекулярной фракции (менее 2000 Да) не более 15% от суммы фракций 2000-8000 Да и менее 2000 Да.

Авторам не известны технические решения, имеющие совокупность признаков, подобных заявляемым. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию новизна.

Изобретение поясняется следующими частными примерами его осуществления.

Пример 1. Примеры получения надропарина кальция с различными соотношениями ингредиентов

ПРИМЕР 1

А) 100 г гепарината натрия растворяют в 900 мл дистиллированной воды при 25°С, добавляют 2 г нитрита натрия и доводят рН раствора до 2.5 соляной кислотой. Выдерживают раствор до исчезновения нитрита (по йод-крахмальной бумаге). Затем доводят рН раствора до 10.5 гидроксидом натрия и добавляют 1.5 г борогидрида натрия. Реакционную смесь перемешивают 20 часов, доводят рН раствора до 3.2 соляной кислотой (что приводит к разрушению избытка борогидрида натрия и повторному повышению рН) и затем доводят рН до 6.8 соляной кислотой. К полученной реакционной массе добавляют 0.5 литра спирта, выдерживают при 25°С 2 часа, отделяют выделившийся продукт центрифугированием.

Выход 14.3 г (более 8000 Да - 54%, 2000-8000 - 44%, менее 2000 - 2%).

К супернатанту добавляют еще 2 л спирта, перемешивают 20 часов при температуре 5°С, продукт отфильтровывают, промывают спиртом и сушат.

Выход 78 г (2000-4000 Да - 41%, 2000-8000 Да - 78%, менее 2000 Да - 13%).

Б) 143 г высокомолекулярной фракции со стадии А) растворяют в 1300 мл дистиллированной воды при 25°С, добавляют 1.2 г нитрита натрия и доводят рН раствора до 2.5 соляной кислотой. Выдерживают раствор до исчезновения нитрита (по йод-крахмальной бумаге). Доводят рН раствора до 10.5 гидроксидом натрия и добавляют 0.8 г борогидрида натрия. Реакционную смесь перемешивают 20 часов, доводят рН раствора до 3.2 соляной кислотой (для разрушения избытка борогидрида натрия) и затем доводят рН до 6.8 соляной кислотой. К полученной реакционной массе добавляют 0.7 литра спирта, выдерживают при 25°С 2 часа, отделяют выделившийся продукт центрифугированием.

Выход 15 г (более 8000 Да - 52%, 2000-8000 - 43%, менее 2000 - 5%).

К супернатанту добавляют еще 3 л спирта, перемешивают 20 часов при температуре 5°С, продукт отфильтровывают, промывают спиртом и сушат.

Выход 81 г (2000-4000 Да - 39%, 2000-8000 Да - 77%, менее 2000 Да - 12%).

С) Объединенные партии продукта со стадий А и Б (159 г) растворяют в 1 литре воды и пропускают через сильнокислый катионит КУ-2-8 (45 мл в кислотной форме). Элюат доводят раствором гидроксида кальция до рН=6.8, отфильтровывают через мембранный фильтр 0.25 мкм для стерилизации и лиофилизируют. Получают 152 г надропарина кальция.

ПРИМЕР 2

А) 100 г гепарината натрия растворяют в 900 мл дистиллированной воды при 24°С, добавляют 2 г нитрита натрия и доводят рН раствора до 2 соляной кислотой. Выдерживают раствор до исчезновения нитрита (по йод-крахмальной бумаге). Затем доводят рН раствора до 9 гидроксидом натрия и добавляют 1.0 г борогидрида натрия. Реакционную смесь перемешивают 15 часов, доводят рН раствора до 3,0 соляной кислотой (что приводит к разрушению избытка борогидрида натрия и повторному повышению рН) и затем доводят рН до 7,0 соляной кислотой. К полученной реакционной массе добавляют 0.45 л спирта, выдерживают при 20°С 1,5 часа, отделяют выделившийся продукт центрифугированием.

Выход 13.7 г (более 8000 Да - 57%, 2000-8000 - 41%, менее 2000 - 2%).

К супернатанту добавляют еще 2,5 л спирта, перемешивают 15 часов при температуре 4°С, продукт отфильтровывают, промывают спиртом и сушат.

Выход 70 г (2000-4000 Да - 40%, 2000-8000 Да - 76%, менее 2000 Да - 13%).

Б) 137 г высокомолекулярной фракции со стадии А) растворяют в 1100 мл дистиллированной воды при 25°С, добавляют 2.5 г нитрита натрия и доводят рН раствора до 2.0 соляной кислотой. Выдерживают раствор до исчезновения нитрита (по йод-крахмальной бумаге). Доводят рН раствора до 9.0 гидроксидом натрия и добавляют 1.0 г борогидрида натрия. Реакционную смесь перемешивают 15 часов, доводят рН раствора до 3.0 соляной кислотой (для разрушения избытка борогидрида натрия) и затем доводят рН до 7,0 соляной кислотой. К полученной реакционной массе добавляют 0.6 литра спирта, выдерживают при 20°С 1,5 часа, отделяют выделившийся продукт центрифугированием.

Выход 16 г (более 8000 Да - 54%, 2000-8000 - 42%, менее 2000 - 4%).

К супернатанту добавляют еще 2,5 л спирта, перемешивают 15 часов при температуре 4°С, продукт отфильтровывают, промывают спиртом и сушат.

Выход 80 г (2000-4000 Да - 38%, 2000-8000 Да - 75%, менее 2000 Да - 14%).

С) Объединенные партии продукта со стадий А и Б (150 г) растворяют в 0,9 литрах воды и пропускают через сильнокислый катионит КУ-2-8 (45 мл в кислотной форме). Элюат доводят раствором гидроксида кальция до рН=7.0, отфильтровывают через мембранный фильтр 0.25 мкм для стерилизации и лиофилизируют. Получают 148 г надропарина кальция.

ПРИМЕР 3

А) 100 г гепарината натрия растворяют в 900 мл дистиллированной воды при 26°С, добавляют 2 г нитрита натрия и доводят рН раствора до 3 соляной кислотой. Выдерживают раствор до исчезновения нитрита (по йод-крахмальной бумаге). Затем доводят рН раствора до 11 гидроксидом натрия и добавляют 2 г борогидрида натрия. Реакционную смесь перемешивают 21 час, доводят рН раствора до 3,2 соляной кислотой (что приводит к разрушению избытка борогидрида натрия и повторному повышению рН) и затем доводят рН до 7,2 соляной кислотой. К полученной реакционной массе добавляют 0.6 литра спирта, выдерживают при 26°С 2,5 часа, отделяют выделившийся продукт центрифугированием.

Выход 14.0 г (более 8000 Да - 53%, 2000-8000 - 44%, менее 2000 - 3%).

К супернатанту добавляют еще 2,5 л спирта, перемешивают 21 час при температуре 6°С, продукт отфильтровывают, промывают спиртом и сушат.

Выход 76 г (2000-4000 Да - 39%, 2000-8000 Да - 77%, менее 2000 Да - 13%).

Б) 140 г высокомолекулярной фракции из стадии А) растворяют в 1300 мл дистиллированной воды при 26°С, добавляют 2.0 г нитрита натрия и доводят рН раствора до 3.0 соляной кислотой. Выдерживают раствор до исчезновения нитрита (по йод-крахмальной бумаге). Доводят рН раствора до 11.0 гидроксидом натрия и добавляют 0.5 г борогидрида натрия. Реакционную смесь перемешивают 21 час, доводят рН раствора до 3.0 соляной кислотой (для разрушения избытка борогидрида натрия) и затем доводят рН до 7,2 соляной кислотой. К полученной реакционной массе добавляют 0.6 литра спирта, выдерживают при 26°С 2,5 часа, отделяют выделившийся продукт центрифугированием.

Выход 16 г (более 8000 Да - 53%, 2000-8000 - 42%, менее 2000 - 5%).

К супернатанту добавляют еще 3,5 л спирта, перемешивают 21 час при температуре 6°С, продукт отфильтровывают, промывают спиртом и сушат.

Выход 80 г (2000-4000 Да - 40%, 2000-8000 Да - 77%, менее 2000 Да - 12%).

С) Объединенные партии продукта из стадий А и Б (156 г) растворяют в 1,2 литре воды и пропускают через сильнокислый катионит КУ-2-8 (45 мл в кислотной форме). Элюат доводят раствором гидроксида кальция до рН=7.2, отфильтровывают через мембранный фильтр 0.25 мкм для стерилизации и лиофилизируют. Получают 150 г надропарина кальция.

Пример 2. Подтверждение подлинности надропарина

Подтверждение подлинности надропарина кальция осуществляли методом ПМР-спектроскопии (рис. 1) и определением биологической активности (отношение активности анти-фактора Ха/анти-фактор-IIa свертывания крови). Отношение активности составило 3,2 (при норме от 2,5 до 4,0).

Пример 3. Надропарин кальция, полученный заявляемым способом, пригоден для лечения заболеваний, требующих введения антикоагулянтов

К данным заболеваниям относятся тромбоз глубоких вен, тромбоэмболия легочной артерии, острый коронарный синдром, профилактика тромбозов у больных с высоким риском: а) при ортопедических, онкологических и общехирургических операциях, б) при гемодиализе и гемофильтрации у больных с хронической почечной недостаточностью.

С лечебной целью: 2 раза в сутки в течение 10 дней, в дозе 225 ЕД/кг (100 МЕ/кг), что соответствует: 45-55 кг - 0,4-0,5 мл; 55-70 кг - 0,5-0,6 мл; 70-80 кг - 0,6-0,7 мл; 80-100 кг - 0,8 мл; более 100 кг - 0,9 мл.

Для профилактики тромбоэмболических осложнений в хирургической практике: п/к 0,3 мл за 2-4 ч до начала операции и по 0,3 мл 1 раз в сутки в последующие 7 дней; в ортопедической хирургии: 100 ЕД/кг (41 МЕ/кг) за 12 ч до и через 12 ч после операции, далее - ежедневно в течение 3 дней, затем - 150 ЕД/кг (61 МЕ/кг) 10 дней. При необходимости введение продолжают до полного восстановления двигательной активности пациента.

Таким образом, разработанный нами способ позволяет вести деполимеризацию в таких условиях, при которых низкомолекулярная фракция (менее 2000 Да) образуется в минимальном количестве (не более 15% от суммы двух фракций 2000-8000 Да и менее 2000 Да), позволил увеличить выход целевого продукта за счет снижения доли низкомолекулярной фракции.

Список литературы

1. В.А. Макаров и др. "Применение гепаринов в клинической практике", 1998, РМЖ, №3, с. 4.

2. Патент РФ 2512768, опубликован 10.04.2014.

3. Европейский патент ЕР 1773890, опубликован 18.04.2007.

4. Патент РФ 2133253, опубликован 20.07.1999.

5. Патент Китая CN 104072638 А, опубликован 01.10.2014.