СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОКЛЕЩЕВОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА ИЗ ДОНОРСКОЙ ИММУННОЙ ПЛАЗМЫ

Изобретение относится к иммунобиологической промышленности и может быть использовано для получения противоклещевого иммуноглобулина из донорской иммунной плазмы.

Получение сырья для производства специфических иммуноглобулинов - процесс не только длительный, но и весьма сложный. Он включает в себя отбор доноров по вирусной безопасности и возможности использования их плазмы в производстве направленных иммуноглобулинов. Данными критериями являются наличие у доноров иммунной плазмы для фракционирования необходимого уровня общего белка не менее 50 г/л и специфического титра антител к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ) не менее 1:20 ME.

Известен способ получения иммуноглобулина для внутривенного введения с использованием метода Кона (RU 2122864, опубл. 10.12.1998 г.), обладающий антикомплементарной активностью не менее 10 мг белка. Однако такой способ не предназначен для получения противоклещевого иммуноглобулина из донорской иммунной плазмы с заданным титром специфической активности в готовом препарате.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения иммуноглобулинов, в том числе противоклещевого, включающий обработку фракций крови раствором неионного детергента и последующим извлечением иммуноглобулинов общепринятыми приемами, а именно по методу Кона (RU 2128508, опубл. 10.04.1999 г.).

Известный способ не позволяет получить иммуноглобулин с требуемым титром специфической активности. Применение этого способа позволяет получать препарат из иммунного сырья донорской плазмы с более высоким уровнем специфических антител к ВКЭ, чем необходимо, а значит, эффективность использования иммунной плазмы будет низкой, поэтому затраты на получение противоклещевого иммуноглобулина будут неоправданно высокими.

Технический результат заключается в повышении эффективности использования иммунной плазмы доноров и снижении затрат на получение противоклещевого иммуноглобулина с титром антител к ВКЭ, равным 1:160 ME за счет уменьшения объема использования дорогостоящей иммунной плазмы доноров с высоким титром, т.е. 1:40 ME и выше.

Технический результат достигается при использовании способа получения противоклещевого иммуноглобулина из донорской иммунной плазмы, включающего фракционирование белков и выделение готового препарата по методу Кона.

Сущность изобретения заключается в том, что предварительно по экспериментальным данным анализов плазмы многочисленной группы доноров осуществляют прогностический расчет среднего титра антител к ВКЭ в прогнозируемой котловой загрузке (Т_{ср.прог}) по следующей формуле:

где

T₁ - титр плазмы 1:10 ME или менее;

V₁ - объем плазмы с титром 1:10 ME или менее;

Т₂ - титр плазмы 1:20 ME;

V₂ - объем плазмы с титром 1:20 ME;

Т₃ - титр плазмы 1:40 ME;

V₃ - объем плазмы с титром 1:40 ME;

Т₄ - титр плазмы 1:80 ME;

V₄ - объем плазмы с титром 1:80 ME;

Т₅ - титр плазмы 1:160 ME;

V₅ - объем плазмы с титром 1:160 ME;

Т₆ - титр плазмы 1:320 ME;

V₆ - объем плазмы с титром 1:320 ME;

V_1+2+3+4+5+6 - общий объем плазмы в экспериментальной загрузке,

затем Т_{ср.прог} сравнивают с титром 1:20 ME и осуществляют разбавление экспериментальной загрузки нормальной плазмой с титром 1:10 ME или менее до получения Т_{ср.прог}=1:20 ME, далее осуществляют котловую загрузку, из которой готовят препарат с титром антител к ВКЭ, равным 1:160 ME.

Специфическая активность готового препарата противоклещевого иммуноглобулина должна быть не менее 1:160 ME. Донорская плазма против ВКЭ имеет уровень специфических антител - не менее 1:20 ME.

Как правило, при производстве специфического иммуноглобулина по методу Кона происходит концентрирование антител примерно в 8-10 раз, поэтому осуществление прогностического расчета среднего титра антител к ВКЭ в прогнозируемой котловой загрузке позволит получать готовый продукт с заданным титром 1:160 ME с максимально возможным выходом, тем самым существенно повысить эффективность использования иммунной плазмы в результате существенного уменьшения объема использования дорогостоящей иммунной плазмы доноров с высоким титром, т.е. 1:40 МЕ и выше.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Исходным сырьем служит карантинизированная плазма крови от группы доноров с заранее известным титром антител к ВКЭ. При формировании котловой загрузки вычисляют объем плазмы с одной и той же величиной титра (от 1:20 до 1:320 ME), т.е. определяют Т₁…Т₆ и соответствующие им V₁…V₆.

Далее по этим данным осуществляют прогностический расчет среднего титра антител к ВКЭ в прогнозируемой котловой загрузке (Т_{ср.прог}) по следующей формуле:

где

T₁ - титр плазмы 1:10 МБ или менее;

V₁ - объем плазмы с титром 1:10 ME или менее;

Т₂ - титр плазмы 1:20 ME;

V₂ - объем плазмы с титром 1:20 МЕ;

Т₃ - титр плазмы 1:40 МЕ;

V₃ - объем плазмы с титром 1:40 ME;

Т₄ - титр плазмы 1:80 МЕ;

V₄ - объем плазмы с титром 1:80 ME;

Т₅ - титр плазмы 1:160 ME;

V₅ - объем плазмы с титром 1:160 ME;

Т₆ - титр плазмы 1:320 ME;

V₆ - объем плазмы с титром 1:320 ME;

V _1+2+3+4+5+6 - общий объем плазмы в экспериментальной загрузке.

Затем Т_{ср.прог} сравнивают с титром 1:20 ME, и если Т_{ср.прог} выше 1:20 ME осуществляют разбавление экспериментальной загрузки нормальной плазмой с титром 1:10 ME или менее до получения Т_{ср.прог}=1:20 МЕ.

Далее проводят фракционирование плазмы котловой загрузки по методу Кона (Cohn Е., Strong L. Huges W. Preparations and properties of serum and plasma proteins // J. Amer. Chem. Soc. -1946, - Vol .68, - P. 459), последовательно изменяя концентрацию этанола с 8 до 25 об. %.

Дальнейшее спиртовое фракционирование загрузки приводит к получению готового препарата с титром антител к ВКЭ, равным 1:160.

Пример 1

Была сформирована 1-я экспериментальная загрузка донорской иммунной плазмы в количестве 174,91 л

T₁=1:10 ME; V₁=35,01 л;

Т₂=1:20 МЕ; V₂=130,64 л;

Т₃=1:40 ME; V₃=8,1 л;

Т₄=1:80 МЕ; V₄=0,29 л;

Т₅=1:160 МЕ; V₅=0,87 л;

Т₆=1:320; V₆=0 л.

Расчет прогнозируемой котловой загрузки по формуле показал, что

Округлив эту величину до целого значения, получаем титр антител к ВКЭ, равный 1:20 ME. Расчет показал, что объема нормальной плазмы с титром 1:10 ME и менее в количестве 35,01 л в качестве добавки будет достаточно для получения титра 1:20 МЕ. Поэтому для получения котловой загрузки с нужным титром было добавлено 35,01 л нормальной плазмы с титром 1:10 ME и менее.

После формирования котловой загрузки производили отбор проб для определения титра антител к ВКЭ в реакции торможения гемагглютинации, который составил 1:20 ME.

Фракционирование осуществляли путем медленного добавления к раствору котловой загрузки плазмы с pH 7,2 охлажденного 50 об. % раствора спирта до концентрации 8 об. % при непрерывном перемешивании и постоянном снижении температуры до минус 3°C. Затем смесь центрифугировали на установках типа СГО-100 при 15000 об/мин и температуре минус 3°C. Осадок стадии А8 являлся балластным, центрифугат передавали на стадию А. К центрифугату А8 (pH 6,8-7,2) добавляли 50 об. % раствор этилового спирта до концентрации 25 об. %.

При непрерывном перемешивании и снижении температуры от минус 3°C до минус 10°C осадок А, полученный при центрифугировании смеси, в количестве 8,5-9,5 кг разводили в солевом растворе в 20 раз и осаждали в тех же условиях. Центрифугировали и получали осадок А'. Этот осадок растворяли в солевом растворе в 25 раз и осаждали охлажденным этиловым спиртом до концентрации 17 об. % (стадия Б).

Центрифугат Б (pH 5,55) выдерживали при температуре минус 4°C в течение 12-14 часов, затем центрифугировали со скоростью 15000 об/мин и температуре минус 4°C (стадия Б1).

Центрифугат Б1 подвергали осветляющей фильтрации. Из осветленного раствора выделяли иммуноглобулин G путем осаждения. Иммуноглобулин из раствора переводили в нерастворенную фазу при добавлении охлажденного 50 об. % этанола при pH 6,8-7,2 и температуре минус 10°C с последующим отделением осадка путем центрифугирования со скоростью 15000 об/мин при температуре минус 10°C.

Полученный осадок в количестве 3,0 кг растворяли в 0,4-0,5% растворе хлорида натрия и подвергали ультрафильтрации на установке типа Sartaflow Beta с использованием кассетных мембранных модулей с размером пор 100 кД. К ультрафильтрату в качестве стабилизатора добавляли глицин из расчета 2,25 г глицина на 100 мл раствора. С полученным ультрафильтратом проводили осветляющую и стерилизующую фильтрацию.

После стерилизующей фильтрации осуществляли отбор проб раствора иммуноглобулина для контроля. Продукт выдерживали при температуре 20-27°C в течение 3-4 недель. По истечении этого срока корректировали физико-химические показатели (9,5-10,5% белка, pH 6,6-7,4).

Затем снова проводили стерилизующую фильтрацию и отбор проб для определения титра специфической активности препарата.

Величина титра антител к ВКЭ готового препарата составила 1:160 ME.

Выход готового препарата с 1 л донорской плазмы составил 3,9 упаковок или 39 ампул.

Пример 2

Была сформирована 2-я экспериментальная загрузка из иммунной плазмы:

T₁=1:10; V₁=0 л;

Т₂=1:20; V₂=83,32 л;

Т₃=1:40; V₃=26,3 л;

Т₄=1:80; V₄=8,9 л;

Т₅=1:160; V₅=1,3 л;

Т₆=1:320; V₆=0 л.

Расчет прогнозируемой котловой загрузки по формуле показал, что

Средний титр прогнозируемой загрузки больше, чем 1:20 ME. Для снижения титра брали нормальную плазму с титром к ВКЭ, равным 1:10 ME и менее в количестве 47,85 л и добавляли в экспериментальную, затем вновь рассчитывали Т_{ср.прог} по указанной формуле. В результате получили:

Средний прогнозируемый титр был равен 1:24,6 ME, что при формировании котловой загрузки показало титр, равный 1:20 МЕ.

Затем осуществляли стадии технологического процесса, описанные в примере 1.

Величина титра антител к ВКЭ готового препарата составила 1:160 ME.

Выход готового препарата с 1 л донорской плазмы составил 4,0 упаковки или 40 ампул.