Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO СОРТА КАРТОФЕЛЯ АЛЕНА

Изобретение относится к биотехнологии растений, в частности к получению безвирусного и продуктивного исходного материала для дальнейшего семеноводства картофеля.

Картофель - вегетативно-размножаемая культура, относительно слабая по устойчивости к вирусам, важнейший продукт питания населения. Россия занимает одно из последних мест по урожайности культуры картофеля. Низкая урожайность связана с резкими температурными колебаниями, инфицированностью почвы возбудителями болезней и низким качеством семенного материала. Зараженность патогенами семенного материала является одной из основных причин снижения урожайности картофеля.

По данным ЗАО «Тепличный» г. Омска (2014), картофель, используемый в промышленном картофелеводстве Омского региона, практически на 100% поражен мозаичными вирусами (X, Y, S, L, М) и вироидами (ВВКК), приводящими к большим потерям урожая (от 50 до 90%), плохому хранению и снижению качества картофеля. Отечественный сибирский сорт картофеля «Алена» высокоурожайный, крупноплодный, ранний имеет отличные вкусовые и качественные характеристики, отличается высокой товарностью, сорт способен давать стабильный урожай в разных почвенно-климатических зонах, при этом он устойчив к температурным стрессам, однако находится на грани полного исчезновения за счет вырождения вирусами и вследствие этого в настоящее время в промышленном картофелеводстве Западной Сибири не используется.

Сибирский сорт картофеля «Алена» рекомендуется к выращиванию не только в Западно-Сибирском регионе, но и в регионах: Волго-Вятский, Уральский Восточно-Сибирский и Дальневосточный.

Известен способ микроклонального размножения картофеля, включающий культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем черенкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, сахарозу, Fe-хелат, глицерин, ИУК, агар-агар, витамины по Уайту, получение меристемных растений-регенерантов и высадку растений в грунт, при этом перед высадкой в грунт меристемные растения-регенеранты подвергаются ежесуточному воздействию температурой +4-+5°C в течение 2 ч продолжительностью 6-7 дней [патент RU №2487532 (13) С1, МПК А01Н 4/00, А01G 7/00, 20.07.2013 (аналог)].

Наиболее близким по технической сущности к заявленному изобретению является способ микроклонального размножения картофеля, включающий культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, сахарозу, глицерин, активированный уголь, аскорбиновую кислоту, получение растений-регенерантов и высадку растений-регенерантов в грунт, причем микрочеренкование исходных растений проводят на апикальную, среднюю и базальную части, выращивание апикальной и средней частей осуществляется на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 20000 мг/л при температуре 23-25°C днем и 17-18°C ночью с последующим высаживанием растений-регенерантов картофеля в грунт, а выращивание базальной части проводят на питательной среде с содержанием сахарозы 80000 мг/л в темноте при температуре 8-10°C с последующим получением микроклубней картофеля in vitro [патент RU 2329639 (13) С2, МПК А01G 4/00, 27.07.2008 (прототип)].

Недостатками данных способов размножения картофеля применительно к генотипу сорта «Алена» являются недостаточно высокая скорость роста растений in vitro, небольшой выход растений-регенерантов и микроклубней из одного исходного растения, маленькие размеры микроклубней и трудоемкость работы с пробирками, которые не позволяют выращивать несколько растений и получать более жизнеспособные микроклубни большего размера и количества, тем самым снижая себестоимость оздоровленных растений и микроклубней.

Техническим результатом заявленного изобретения является возрождение и получение в короткие сроки оздоровленного сибирского сорта картофеля «Алена», повышение коэффициента размножения растений-регенерантов, размеров и количества микроклубней, ускорение роста эксплантов, обеспечение технической простоты культивирования и снижение трудоемкости работы. Конечной целью изобретения является обеспечение импортозамещения используемых голландских и немецких сортов картофеля.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе микроклонального размножения картофеля, включающем стерилизацию питательной среды, культивирование растений картофеля in vitro путем микрочеренкования исходных растений на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, аскорбиновую кислоту, получение растений-регенерантов, получение микроклубней картофеля in vitro с использованием питательной среды, согласно заявляемому изобретению осуществляют предварительное оздоровление исходных растений картофеля от вирусной инфекции стерилизацией в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной H₂O, причем для культивирования оздоровленных растений и получения микроклубней картофеля используют питательную среду, содержащую дополнительно аденин 1-1,5 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,5-1,5 мг/л, а тиамин, аскорбиновая кислота, Fe-хелат и сахароза берутся в следующей концентрации: 1-1,2 мг/л; 2,1-4 мг/л; 374-390 мг/л и 81000-85000 мг/л, получение микроклубней картофеля осуществляют при температуре 19-20°C, при условии светового дня 8 часов (5000 лк) и полной темноты 16 часов и относительной влажности воздуха 70-80%.

Стерилизацию питательной среды для культивирования оздоровленных растений и получения микроклубней картофеля осуществляют с использованием автоклавов в стеклянных банках с металлической герметичной крышкой и вырезанным отверстием в крышке для внесения эксплантов.

Опыты проводились в условиях научно-производственной лаборатории «Прикладная биотехнология» ФГБОУ ВО «Омский государственный технический университет» с сортом картофеля «Алена».

Способ осуществляют следующим образом.

Оздоровление картофеля от вирусной инфекции осуществлялось вычленением апикальных этиолированных проростков, разделением их на кусочки (1-1,5 см с одной почкой), стерилизацией в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной H₂O.

Использование 0,3%-ного раствора диацида с целью стерилизации выделенных этиолированных проростков в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной H₂O позволяет полностью ингибировать развитие бактериальной и вирусной инфекции.

Экспериментально было доказано, что использование диацида менее 0,3%-ного раствора не позволяет полностью стерилизовать растительные экспланты от бактериальной и вирусной инфекции. Использование диацида более 0,3%-ного раствора приводит к частичному замедлению процессов регенерации или гибели растений.

После стерилизации растительных эксплантов из них вычленяют апикальные меристемы и вносят их на стерильную питательную среду (табл. 1), содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, сахарозу 20000 мг/л, кинетин 1-2 м г/л, ИУК 1-2 мг/л для морфогенеза и образования меристемных оздоровленных растений-регенерантов.

Питательная среда в контрольном варианте готовилась по прототипу, в опытном - с добавлением 374-390 мг/л Fe-хелата, 0,5-1,5 мг/л ИУК, 1-2 мг/л кинетина, 1-1,5 мг/л аденина, 1,0-1,2 мг/л тиамина, 2,1-4 аскорбиновой кислоты, 81000-85000 мг/л сахарозы.

Для культивирования растений-регенерантов используют стеклянные банки с металлической герметичной крышкой, с вырезанным отверстием в крышке для внесения эксплантов, которые выдерживают условия автоклавирования. После внесения в банку питательной среды отверстие закрывают ватно-марлевой пробкой и обворачивают фольгой, помещают в медицинские бюксы и автоклавируют 20 мин при давлении 1 атм и температуре 120°C.

При использовании стеклянных банок с металлической крышкой и отверстием для внесения эксплантов снижается себестоимость оздоровленных растений и микроклубней, увеличивается выход и размер микроклубней, упрощается способ размножения. Следует отметить, что использование пробирок - дорогой, громоздкий, трудоемкий процесс, а микроклубни, полученные в пробирках, имеют меньшие размеры и менее жизнеспособны.

Также следует отметить, что применение стеклянных банок с металлической крышкой для культивирования растений-регенерантов и микроклубнеобразования экономически выгоднее контейнерной технологии, т.к. позволяет использовать банки многократно, подвергать их автоклавированию, в отличие от пластиковых контейнеров и громоздких пробирок. Себестоимость стеклянных банок гораздо дешевле пробирок и пластиковых контейнеров.

Размножение оздоровленных растений-регенерантов проводили микрочеренкованием in vitro в условиях ламинар-бокса. Микрочеренки помещали в стерильные стеклянные банки со стерильной питательной средой, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, агар-агар, витамины: тиамин 1-1,2 мг/л и аскорбиновую кислоту 2,1-4 мг/л; Fe-хелат 374-390 мг/л, сахарозу 81000-85000 мг/л, аденин 1-1,5 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,5-1,5 мг/л.

Повышение содержания витаминов тиамина до 1-1,2 мг/л и аскорбиновой кислоты 2,1-4 мг/л способствует более интенсивному росту и здоровому развитию растения, более мощному развитию корневой системы, стимулированию ростовых процессов, влиянию на обмен веществ в растении.

В результате проведенных исследований установлено, что повышение содержания эссенциального элемента Fe-хелат с 374 до 390 мг/л оказывает положительное влияние на процессы фотосинтеза и дыхание растений картофеля, т.к. элементы Fe-хелат являются переносчиками электронов, а как кофактор Fe-хелат у растений картофеля входит в состав многих антиоксидантных ферментов (Fe-супероксиддисмутаза, пероксидазы, каталаза).

Экспериментально установлено, что введение в питательную среду сахарозы в количестве 81000-85000 мг/л более интенсивнее стимулирует процесс индукции микроклубнеобразования, повышает выход и размеры микроклубней у генотипа сорта картофеля «Алена».

Введенный в состав питательной среды аденин - аминопроизводное пурина - содержится в ферментах и коферментах растений картофеля, очень важен для клеток растений как составляющая нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), и в культуре тканей имеет цитокининовый эффект, т.е. стимулирует образование побегов растений (дифференциацию), резко усиливает процессы клеточного деления (цитокинез), повышает интенсивность фотосинтеза у растений картофеля, а также участвует во многих физиологических процессах.

Комплексное использование в питательной среде ИУК, аденина и кинетина и взаимовлияние их друг на друга способствует более интенсивному стимулированию ростовых процессов, ризогенезу, геморизогенезу, морфогенезу и приживаемости растений. Учитывая, что соотношение ауксинов к цитокининам является ключевым фактором деления клеток и дифференцировки тканей растения картофеля, поэтому экспериментальным путем было установлено оптимальное соотношение и концентрации внесения в питательную среду ауксинов и цитокининов (ИУК 0,5-1,5 мг/л, аденина 1-1,5 мг/л и кинетина1-2 мг/л).

На следующем этапе банки с черенками подписывали и выставляли на стеллажи с освещением 5000-лк люминесцентными лампами при фотопериоде: 16-часовом освещении (день) и 8 часов полной темноты (ночь), при температуре 22-25°C, влажности воздуха 70% для дальнейшего получения растений-регенерантов, которые могут быть реализованы для высадке в грунт.

Для получения микроклубней картофеля использовали ту же питательную среду, которая использовалась выше для микрочеренкования, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, агар-агар, витамины: тиамин 1-1,2 мг/л и аскорбиновую кислоту 2,1-4 мг/л; Fe-хелат 374-390 мг/л, сахарозу 81000-85000 мг/л, аденин 1-1,5 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,5-1,5 мг/л, однако режимы культивирования были следующие: 8 часов освещения (5000-7000 лк), 16 часов полной темноты, при пониженной температуре 19-20°C и относительной влажности воздуха 70-80%.

Полученные микроклубни отделяли от растений и переносили в условия пониженных температур (4±2)°C на 2-3 месяца для дальнейшей реализации или высадки в грунт.

Полученные предлагаемым способом оздоровленные микроклубни картофеля были физиологически зрелыми, хорошо хранились и при последующем выращивании in vivo формировали здоровые растения. Предлагаемый способ прост в использовании, экологически безопасен и может быть использован на картофелевыращивающих предприятиях.

Пример 1. Оздоровление картофеля от вирусной инфекции осуществлялось вычленением апикальных этиолированных проростков исходных растений, разделением их на кусочки (1-1,5 см с одной почкой), стерилизацией в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут, с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной H₂O.

После стерилизации растительных эксплантов из них вычленяют апикальные меристемы и вносят их на стерильную питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, сахарозу 20000 мг/л, кинетин 1,5 мг/л, ИУК 1,5 мг/л для морфогенеза и образования меристемных оздоровленных растений-регенерантов.

Для культивирования растений-регенерантов используют стерильные стеклянные банки с металлической герметичной крышкой и вырезанным отверстием в крышке для внесения эксплантов. После внесения оздоровленных эксплантов в стерильную банку со стерильной питательной средой отверстие закрывают ватно-марлевой пробкой, банки с эксплантами подписывают и выставляют на стеллажи с освещением 5000-лк люминесцентными лампами при фотопериоде: 16-часовом освещении (день) и 8 часов полной темноты (ночь), при температуре 22-25°C, влажности воздуха 70% для дальнейшего получения растений-регенерантов. Полученные растения-регенеранты, имеющие 12-15 листьев, извлекают из банок и черенкуют в условиях ламинар-бокса, и черенки помещают в стерильные банки со стерильной питательной средой, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, агар-агар, тиамин 1,2 мг/л, аскорбиновую кислоту 3 мг/л; Fe-хелат 380 мг/л, сахарозу 85000 мг/л, аденин 1,5 мг/л, кинетин 2 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 1,5 мг/л.

На следующем этапе банки с черенками подписывают и выставляют на стеллажи с освещением 5000-лк люминесцентными лампами при фотопериоде: 16-часовом освещении (день) и 8 часов полной темноты (ночь), при температуре 22-25°C, влажности воздуха 70% для дальнейшего получения растений-регенерантов, которые могут быть реализованы для высадки в грунт.

Для получения микроклубней картофеля использовали ту же питательную среду, что и для микрочеренкования при условиях культивирования: 8 часов освещения (5000-7000 лк), 16 часов полной темноты, при пониженной температуре 19-20°C и относительной влажности воздуха 70-80%.

Полученные микроклубни отделяют от растений и переносят в условия пониженных температур (4±2)°C на 2-3 месяца для дальнейшей реализации или высадке в грунт.

По окончании культивирования микроклубни отделяются и направляются на реализацию потребителям для высадки семенного картофеля в грунт или переносятся на хранение в холодильные камеры при температуре (4±2)°C сроком на 2-3 месяца до момента реализации.

Пример 2. Осуществляется аналогично примеру 1 за исключением того, что для культивирования оздоровленных растений и получения микроклубней картофеля используется питательная среда, содержащая компоненты в следующем количестве: тиамин 1,0 мг/л, аскорбиновую кислоту 4 мг/л; Fe-хелат 390 мг/л, сахарозу 84000 мг/л, аденин 1,0 мг/л, кинетин 1,5 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 1,0 мг/л.

Пример 3. Осуществляется аналогично примеру 1 за исключением того, что для культивирования оздоровленных растений и получения микроклубней картофеля используется питательная среда, содержащая компоненты в следующем количестве: тиамин 1,1 мг/л, аскорбиновую кислоту 2,5 мг/л; Fe-хелат 375 мг/л, сахарозу 82000 мг/л, аденин 1,3 мг/л, кинетин 1,0 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,5 мг/л.

Использование заявляемого способа микроклонального размножения картофеля in vitro позволяет получить безвирусные растения-регенеранты отечественного сорта картофеля «Алена» с повышенной жизнеспособностью, приживаемостью, высокими морфометрическими показателями и увеличенным выходом и размерами микроклубней.

Полученные предлагаемым способом оздоровленные микроклубни картофеля были физиологически зрелыми, хорошо хранились и при последующем выращивании in vivo формировали здоровые растения.

Предлагаемый способ прост в использовании, экологически безопасен и может быть использован на картофелевыращивающих предприятиях.