Применение азопроизводных фенилсульфокислот в качестве ингибиторов образования конечных продуктов гликирования

Изобретение относится к применению производных 4-((пиридин-2-ил)диазенил)фенилсульфокислот и их солевых и сокристальных форм общей формулы I в качестве ингибиторов образования конечных продуктов гликирования (далее КПГ):

,

где R¹=R²=Н; или R¹ и R² вместе образуют заместитель вида CR³R⁴, где R³=Н, СН₃, R⁴=Н, СН₃, С₂Н₅, i-С₃Н₇, С₇Н₁₅, C₈H₁₇, или R⁴ R⁵ вместе образуют спироциклоалкильную группу, где R³, R⁴ = цикло-C₅H₈, цикло-С₆Н₁₀;

Х⁺=Н, катионы щелочных и щелочноземельных металлов, такие как Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Са²⁺ и др., NH₄⁺ и другие фармацевтически приемлемые катионы органической и неорганической природы.

Соединения формулы I являются эффективными ингибиторами образования конечных продуктов гликирования и могут найти широкое применение в медицине в области лечения социально-значимых заболеваний, а именно осложнения сахарного диабета, атеросклероз, ревматоидный артрит, остеоартрит, нейродегенеративные заболевания, включая болезни Альцгеймера и Паркинсона.

Из исследованного заявителем уровня техники выявлено, что производные 4-((пиридин-2-ил)диазенил)фенилсульфокислот общей формулы I, в которых R¹ и R² вместе образуют заместитель вида CR³R⁴, где R³, R⁴ выбраны из группы: атом водорода, метил, линейный, разветвленный алкил, или R³ и R⁴ вместе образуют спироциклоалкильную группу, обладают антибактериальной активностью в отношении как грамотрицательных бактерий Proteus vulgaris, Pseudomonas aeroginosa, так и грамположительной бактерии Staphylococcus aureus ([1] Ю.Г. Штырлин, А.С. Петухов, А.Д. Стрельник, Е.В. Никитина, М.Р. Гарипов, Пат. РФ 2480471, опубл. 27.04.2013).

Также было выявлено, что производные 4-((пиридин-2-ил)диазенил)фенилсульфокислот общей формулы I, в которых R¹ и R² вместе образуют заместитель вида CR³R⁴, где R³ - атом водорода или метил, R⁴ - атом водорода, метил, изопропил, этил, гептил или октил обладают высокой антагонистической активностью по отношению к пуринорецепторам ([2] Ю.Г. Штырлин, А.Д. Стрельник, О.С. Калинина, А.У. Зиганшин, Пат. РФ 2554883, опубл. 27.06.2015; [3] Ю.Г. Штырлин, А.Д. Стрельник, О.С. Калинина, А.У. Зиганшин, Пат. РФ 2554885, опубл. 27.06.2015).

Общим недостатком известных технических решений [1], [2] и [3] является то, что они не содержат информации об антигликирующей активности соединений формулы I.

Таким образом, проведенный заявителем анализ уровня техники не выявил данных о возможности применения производных 4-((пиридин-2-ил)диазенил)фенилсульфокислот и их солевых и сокристальных форм общей формулы I в качестве ингибиторов образования конечных продуктов гликирования.

Как известно в целом из уровня техники, гликирование (неферментативное гликозилирование, реакция Майяра) - это химическая реакция, в которой карбонильные группы восстановленных сахаров связываются с аминогруппами долгоживущих белков, липидов или пептидов, с образованием конечных продуктов гликирования (КПГ) ([4] S. Khangholi, F.A. Abdul Majid, N.J.A. Berwary, F. Ahmad, R. Bin Abd Aziz, Planta Med., 2016; 82: 32-45; [5] V.P. Singh, A. Bali, N. Singh, A.S. Jaggi, Korean J. Physiol. Pharmacol., 2014, 18: 1-14).

При этом внутри- и внеклеточное накопление КПГ считают важным фактором патогенеза таких заболеваний, как атеросклероз ([6] М. Busch, S. Franke, С. Rtister, G. Wolf, European Journal of Clinical Investigation, 2010, 40(8): 742-755), сердечная недостаточность, воспаление, ревматоидный артрит и остеоартрит, нейродегенеративные заболевания, включая болезни Альцгеймера и Паркинсона ([7] J. Li, D. Liu, L. Sun, Y. Lu, Z. Zhang, Journal of the Neurological Sciences, 2012, 317: 1-5).

Особенно интенсивно данный процесс протекает при сахарном диабете, при этом скорость образования КПГ зависит от уровня и длительности экспозиции глюкозы ([8] R. Ramasamy, S.F. Yan, A.M. Schmidt, Ann. N.Y. Acad ScL, 2011, 1243: 88-102; [9] М.И. Балаболкин, Сахарный Диабет, 2002, 4: 8-16).

Эффекты КПГ могут быть классифицированы как рецептор-независимые или - зависимые, и КПГ могут действовать внутриклеточно или циркулировать и действовать на рецепторы клеточной поверхности, такие как рецептор для КПГ (РКПГ). Поскольку гликирование происходит в течение длительного периода времени, КПГ влияют на долгоживущие белки. Например, главными мишенями для них являются структурные компоненты соединительной ткани, в частности коллаген типа IV, а также другие долгоживущие белки, в том числе миелин, тубулин, кристаллин, активатор плазминогена 1, фибриноген, которые могут также подвергаться гликированию ([10] S.-Y. Goh, М.Е. Cooper. J Clin Endocrinol Metab, 2008, 93 (4): 1143-1152).

Связываясь с мембранными РКПГ, конечные продукты гликирования активируют некоторые внутриклеточные сигнальные пути. Например, усиливают транскрипцию ядерного фактора NF-κВ и его генов-мишеней, активируют протеинкиназу С и NADPH-оксидазу, что приводит к увеличению образования провоспалительных цитокинов, свободных радикалов, хемоаттрактантов ([4]; [11] S.C. Но, P.W. Chang, Am. J. Plant. Sci., 2012, 3: 995-1002).

Все вышеперечисленное лежит в основе патогенеза таких последствий сахарного диабета, как диабетические атеросклероз, нефро-, нейро-, ретино-, кардио-, ангиопатии, которые являются причиной высокого риска инвалидизации и смертности среди пациентов с сахарным диабетом.

Применение соединений, обладающих высокой антигликирующей активностью, позволит уменьшить образование КПГ в организме, тем самым улучшая качество жизни пациентов, снижая риск возникновения атеросклероза, ревматоидного артрита, остеоартрита, нейродегенеративных заболеваний, включая болезни Альцгеймера и Паркинсона, а также таких осложнений сахарного диабета, как диабетические атеросклероз, нефро-, нейро-, ретино-, кардио-, ангиопатии, которые являются причиной высокого риска инвалидизации и смертности среди пациентов с сахарным диабетом.

Все вышеперечисленное обусловливает повышенный интерес в мире к поиску ингибиторов образования конечных продуктов гликирования, поскольку препаратов, специфически угнетающих образование КПГ и разрешенных для клинического применения, в мире на дату представления настоящей заявки не существует.

Проведенный заявителем анализ российских и зарубежных патентных баз данных, научной литературы и Интернет-ресурсов показал, что существуют аналоги заявленного технического решения по назначению, способные ингибировать образование КПГ, которые, однако, обладают значительными недостатками, а именно недостаточно высокой эффективностью и/или существенными побочными эффектами, например обладают высокой токсичность и т.д.

Далее заявителем приведена информация о выявленных препаратах, вышедших на стадию клинических испытаний. Первым и наиболее изученным веществом, ингибирующим гликирование белков, является аминогуанидин (АГ) ([12] A. Cerami, Р.С. Ulrich, М. Brownlee, Pat US 4758583 A, опубл. 19.07.1988). Он предназначен для предотвращения формирования КПГ и глюкозо-производных поперечносшитых молекул коллагена. Механизм антигликирующего действия аминогуанидина связывают с его способностью захватывать реактивные дикарбонильные интермедиаты. Однако клинические испытания данного препарата были остановлены в связи с его недостаточной эффективностью и наличием побочных эффектов.

В настоящее время проводятся клинические испытания пиридоксамина ([13] R. Khalifah, B.G. Hudson, Pat US 6716858 B1, опубл. 06.04.2004), также обладающего антигликирующими свойствами, но он тоже проявляет невысокую активность, сопоставимую с аминогуанидином, снятым с клинических испытаний. Других аналогов заявленного технического решения, используемых по назначению и вошедших на стадию клинических исследований, на дату предоставления настоящей заявки заявителем не выявлено.

Таким образом, на дату представления заявочных материалов, проблема создания высокоактивных ингибиторов образования КПГ, разрешенных к клиническому применению, остается нерешенной не только в РФ, но и за рубежом.

Заявленное техническое решение иллюстрируют следующие материалы:

- схемы 1, 2, на которых представлены схемы синтеза целевых веществ;

- таблица 1, на которой представлена антигликирующая активность наиболее активных соединений по сравнению с прототипом (аминогуанидином);

- таблица 2, на которой представлен показатель IC₅₀ наиболее активных соединений по сравнению с прототипом (аминогуанидином).

Задачей заявленного технического решения является поиск соединений, обладающих высокой антигликирующей активностью, которые обеспечивают возможность вывода на рынок новых лекарственных средств, не имеющих аналогов в мире.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является применение в качестве ингибиторов образования КПГ соединений, обладающих значительно более высокой антигликирующей активностью по сравнению с веществами, вышедшими на стадию клинических исследований.

Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что в качестве ингибиторов образования КПГ используют производные 4-(пиридин-2-илдиазенил)фенилсульфокислот общей формулы I, обладающие более высокой (до 20 раз и боле) антигликирующей активностью по сравнению с аминогуанидином по прототипу.

,

где R¹=R²=Н, или R¹ и R² вместе образуют заместитель вида CR³R⁴, где R³=Н, СН₃, R⁴=Н, СН₃, С₂Н₅, i-С₃Н₇, С₇Н₁₅, C₈H₁₇, или R³ R⁴ вместе образуют спироциклоалкильную группу, где R³, R⁴ = никло-С₅Н₈, цикло-С₆Н₁₀;

Х⁺=Н, катионы щелочных и щелочноземельных металлов, такие как Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Са²⁺ и др., NH₄⁺ и другие фармацевтически приемлемые катионы органической и неорганической природы.

Заявленные соединения синтезируют по реакции азосочетания пиридоксина гидрохлорида (1) или семичленных ацеталей пиридоксина 2(а-и) с диазониевыми солями, полученными из сульфаниловой кислоты при температуре 0-5°С ([1], [3]) согласно нижеприведенным схемам 1 и 2.

Примеры конкретного выполнения заявленного технического решения

Пример 1. Определение антигликирующей активности.

Реакцию гликирования воспроизводят по методу A. Jedsadayanmata ([14] А. Jedsadayanmata, Naresuan University Journal, 2005, 13 (2): 35-41). Реакционная смесь содержит растворы бычьего сывороточного альбумина (1 мг/мл) и глюкозы (500 мМ) в фосфатном буфере (рН 7.4). Для предупреждения бактериального роста в буферный раствор вносят азид натрия в конечной концентрации 0.02%. Все вещества растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО). В экспериментальные образцы добавляют 30 мкл раствора изучаемых веществ в различных концентрациях, в контрольные образцы добавляют ДМСО в аналогичном объеме. Все экспериментальные образцы инкубируют в течение 24 часов при 60°С. По истечении срока инкубации проводят определение специфической флуоресценции гликированного бычьего сывороточного альбумина (БСА) на спектрофлуориметре F-7000 (Hitachi, Япония) при длине волны возбуждения 370 нм и испускания 440 нм. В качестве вещества сравнения используют известный ингибитор гликирования аминогуанидин (таблица 1) ([15] P.J. Thornalley, Archives of Biochemistry and Biophysics, 2003, 419: 31-40).

Статистическую обработку результатов проводят с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни, табличного редактора Microsoft Excel 2007 и программы GraphPad Prism 5.0. Расчет показателя IC₅₀ проводят методом регрессионного анализа (таблица 2).

Анализ данных, приведенных в таблице 1 и таблице 2, позволяет сделать вывод, что вещества проявляют высокий уровень антигликирующей активности (таблица 1), что позволяет определить зависимость их эффекта от концентрации и рассчитать показатель IC₅₀ (таблица 2).

Таким образом, полученные заявителем результаты свидетельствуют о том, что все вещества по активности превосходят аминогуанидин в 6.8-22 раза, что позволяет применять их в качестве ингибиторов образования конечных продуктов гликирования.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что заявленное техническое решение позволяет создать новые высокоэффективные и безопасные лекарственные средства для профилактики и лечения микро- и макрососудистых осложнений сахарного диабета, атеросклероза, нейродегенеративных заболеваний, тем самым улучшая качество жизни пациентов.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, обладающие заявленной совокупностью отличительных признаков, обеспечивающих достижение заявленных результатов.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как не является очевидным для специалиста в данной области науки и техники.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», т.к. может быть реализовано на любом специализированном предприятии с использованием стандартного оборудования, известных отечественных материалов и технологий.