Результат интеллектуальной деятельности: Способ идентификации вариантов А и В вируса герпеса человека 6-го типа

Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики вирусных инфекций и может быть использовано для генотипирования вируса герпеса 6-го типа (ВГЧ-6). Впервые вирус герпеса ВГЧ-6 был выделен в 1986 г. из крови пациента с лимфомой (Salahuddin S.Z., Ablashi D.V., Markham P.D., et al. Isolation of a new virus, HBLV, in patients with lymphoproliferative disorders. Science 1986; 234 (4776): 596-601). Вирус герпеса человека 6 типа - это общее наименование двух вариантов ВГЧ-6-А (ВГЧ-6А) и В (ВГЧ-6В), однако согласно новой международной классификации, принятой в 2012 г., ВГЧ-6А и ВГЧ-6В являются самостоятельными таксономическими единицами, соответственно, общее число известных вирусов герпеса человека увеличилось с восьми до девяти (Adams M.J., Carstens Е.В. Ratification vote on taxonomic proposals to the International Committee on Taxonomy of Viruses. Arch Virol 2012; 157 (7): 1411-22). Оба варианта ВГЧ-6 относят к подсемейству бетагерпесвирусов, роду Roseolovirus. Генетический материал ВГЧ-6 представлен двухцепочечной ДНК, причем ВГЧ-6А и ВГЧ-6В различаются по особенностям культивирования, последовательности нуклеотидов и клинико-эпидемиологическим показателям. В зависимости от сравниваемого гена последовательность ДНК двух вариантов вируса совпадает на 75-95% (Isegawa Y., Mukai Т., Nakano K., et al. Comparison of the complete DNA sequences of human herpesvirus 6 variants A and B.J Virol 1999; 73 (10): 8053-63; Dominguez G., Dambaugh T.R., Stamey F.R., Dewhurst S., Inoue N., Pellett P.E. Human herpesvirus 6B genome sequence: coding content and comparison with human herpesvirus 6A. J Virol 1999; 73 (10): 8040-52; Achour A., Malet I., Le Gal F., et al. Variability of gB and gH genes of human herpesvirus-6 among clinical specimens. J Med Virol 2008; 80 (7): 1211-21). Имеют место географические различия в распространенности двух типов ВГЧ-6, хотя возможна и одновременная циркуляция обоих типов вируса на одной территории (Leibovitch Е.С., Brunetto G.S., Caruso В. Coinfection of Human Herpesviruses 6A (HHV-6A) and HHV-6B as Demonstrated by Novel Digital Droplet PCR Assay. PLoS One. 2014; Vol. 9 (3) eCollection). ВГЧ-6А описан как более нейровирулентный по сравнению с ВГЧ-6В и часто выявляется у пациентов с демиелинизирующими заболеваниями, такими как рассеянный склероз (Nitsche A., Muller C.W., Radonic A., et al. Human herpesvirus 6A DNA is detected frequently in plasma but rarely in peripheral blood leukocytes of patients after bone marrow transplantation. J Infect Dis. 2001; 183 (1): 130-3; Cone R.W., Huang M.L., Hackman R.C., Corey L. Coinfection with human herpesvirus 6 variants A and В in lung tissue. J Clin Microbiol 1996; 34 (4): 877-81; Hall C.B., Caserta M.T., Schnabel K.C., et al. Persistence of human herpesvirus 6 accord- ing to site and variant: possible greater neurotropism of variant A. Clin Infect Dis 1998; 26 (1): 132-7; Alvarez-Lafuente R., De Las Heras V., Bartolome M., Picazo J.J., Arroyo R. Relapsing-remitting multiple sclerosis and human herpesvirus 6 active infection. Arch Neurol 2004; 61 (10): 1523-7; Crawford J.R., Kadom N., Santi M.R., Mariani В., Lavenstein B.L. Human herpesvirus 6 rhombencephalitis in immunocompetent children. J Child Neurol. 2007; 22 (11): 1260). ВГЧ-6В при первичном заражении является причиной распространенной детской болезни - розеолы, также известной как внезапная экзантема (exanthema subitum) или «шестая болезнь» (Yamanishi K., Okuno Т., Shiraki К. et al. Identification of human herpesvirus-6 as a causal agent for exanthem subitum. Lancet. 1988; 1 (8594): 1065).

В настоящее время в России дифференциация вариантов (генотипирование) ВГЧ-6 в диагностических целях не проводится. В связи с этим определение вариантов ВГЧ-6А и ВГЧ-6В представляет интерес не только для клинической лабораторной диагностики, но и для популяционных исследований возбудителей и эпидемиологии вызываемых ими заболеваний человека.

Наиболее близким по сущности к заявленному изобретению является способ дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В (JP 2003135100 A, 2003-05-13, https://patents.google.com/patent/JP2003135100A/en) методом ПЦР с последующей электрофоретической детекцией продуктов амплификации фрагмента гена U89/90 ВГЧ-6, различающихся по молекулярной массе у ВГЧ-6А и ВГЧ-6В за счет присутствия инсерций размерами 228 пар нуклеотидов (п.н.) и 108 п.н. соответственно. Недостатком способа является использование электрофоретической детекции, требующей специального оборудования и отдельной рабочей зоны в лаборатории. Таким образом, актуальна разработка быстрого и простого способа дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка быстрого и надежного способа идентификации вариантов ВГЧ-6 посредством амплификации ДНК и флуоресцентной детекции с использованием специфических для ВГЧ-6А и ВГЧ-6В расщепляемых зондов TaqMan методом ПЦР в формате реального времени.

Технический результат от использования изобретения заключается в сокращении времени, упрощении процедуры и однозначности интерпретации результата исследования, что повышает надежность диагностики.

Проведенный авторами анализ полного генома штаммов ВГЧ-6 (GenBank: KJ123690.1, КС465951.1, АВ021506.1, AF157706.1) позволил выявить у ВГЧ-6А и ВГЧ-6В два однонуклеотидных полиморфизма на участке гена U67, ограниченного последовательностями 5'-CGGATACAGTAAGACGGGATAT-3' и 5'-ACGTAAGCTTGCACAATGC-3' (Фиг. 1).

Задача реализуется за счет того, что применяют ПЦР в режиме реального времени с использованием сконструированных авторами специфических праймеров HHV6F 5'-CGGATACAGTAAGACGGGATAT-3' и HHV6R 5'-ACGTAAGCTTGCACAATGC-3' для амплификации участка гена U67; зондов, меченных флуорофорами (F1 и F2), и соответствующими им гасителями (Q1 и Q2) - HHV6AZ F1-GCAATAGATTTGGAAACGCGGCAT-Q1 и HHV6BZ F2-GCAATAGATTCGGAAATGCGGCAT-Q2, для выявления ВГЧ-6А и ВГЧ-6В соответственно. Определение варианта ВГЧ-6 осуществляют по наличию экспоненциального роста флуоресцентного сигнала в соответствующем канале детектирующего амплификатора: вариант ВГЧ-6А - канал F1, вариант ВГЧ-6В - канал F2.

Преимущества предлагаемого способа: быстрота, простая и однозначная интерпретация результатов генотипирования ВГЧ-6 с диагностической целью и при популяционных исследованиях возбудителя. Исследования могут проводиться в одной пробирке на детектирующих амплификаторах с двумя и более каналами детекции.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где Фиг. 1 - Нуклеотидная последовательность фрагмента гена U67 с однонуклеотидными полиморфизмами (выделены цветом) штаммов ВГЧ-6А (1, 2) и ВГЧ-6В (3, 4); показана локализация праймеров (выделены цветом и стрелками) и флуоресцирующих зондов; Фиг. 2а) - схема ПЦР в формате реального времени. F1 и F2 - флуорофоры, Q1 и Q2 - гасители флуоресценции, Taq - Taq ДНК полимераза; красными крестиками обозначены два однонуклеотидных полиморфизма в гене U67. б). Схема накопления сигнала флуоресценции по каналам F1 для ВГЧ-6А, F2 - ВГЧ-6В и двум каналам F1+F2 одновременно - ВГЧ-6А и ВГЧ-6В.

Способ осуществляется следующим образом.

Выделение ДНК ВГЧ-6 из образцов биологического материала проводится согласно инструкции, прилагаемой к используемому набору для экстракции ДНК.

Для проведения ПЦР в формате реального времени использовали сконструированные авторами:

1) праймеры HHV6F 5'-CGGATACAGTAAGACGGGATAT-3' и HHV6R 5'-ACGTAAGCTTGCACAATGC-3';

2) расщепляемые флюоресцентные зонды TaqMan с гасителями, специфичные вариантам ВГЧ-6: HHV6AZ F1-GCAATAGATTTGGAAACGCGGCAT-Q1 и HHV6BZ F2-GCAATAGATTCGGAAATGCGGCAT-Q2.

В процессе амплификации ДНК зонды конкурируют за связывание с матрицей ДНК на участке гена U67 ВГЧ-6, содержащем два однонуклеотидных полиморфизма (Фиг. 1). При этом преимущество получает зонд, соответствующий представленному в образце варианту ВГЧ-6. Если присутствуют оба варианта ВГЧ-6, гибридизуются оба зонда. После гибридизации зонды расщепляются за счет экзонуклеазной активности Taq-полимеразы, удлиняющей праймеры HHV6F 5'-CGGATACAGTAAGACGGGATAT-3' и HHV6R 5'-ACGTAAGCTTGCACAATGC-3', в результате чего повышается уровень флуоресценции, что фиксирует амплификатор в соответствующем канале регистрации в режиме реального времени. Варианты ВГЧ-6 определяли по наличию экспоненциального роста флуоресцентного сигнала в соответствующем канале детектирующего амплификатора: вариант ВГЧ-6А - канал F1, вариант ВГЧ-6В - канал F2, оба варианта ВГЧ-6А+ВГЧ-6В - каналы F1+F2 одновременно (Фиг. 2).

Оценка результатов.

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам F1 и F2 - анализируются с использованием программного обеспечения амплификатора, используемого для проведения ПЦР в формате реального времени. По каналу F1 регистрируется накопление продукта амплификации фрагмента ДНК, специфического для варианта ВГЧ-6А, по каналу F2 - ВГЧ-6В. Выявление сигнала флуоресценции по обоим каналам F1 и F2 свидетельствует о присутствии в исследуемом материале одновременно ВГЧ-6А и ВГЧ-6В. При отсутствии сигнала флуоресценции по обоим каналам делается вывод о недостаточном количестве и/или качестве ДНК или ингибировании реакции ПЦР и невозможности какого-либо вывода о наличии или отсутствии ДНК ВГЧ-6А или ВГЧ-6В в образце.

Использование заявленного способа иллюстрируется примерами, которые не исчерпывают всех возможных вариантов реализации изобретения.

Пример

Для анализа использовали смесь для амплификации объемом 30 мкл, которая содержала 50 мM Tris-SO₄, pH 8,0; 10 мМ (NH₄)₂SO₄; 3,5 мM MgCl₂; 30 мM KCl; 0,01% Tween-20; по 0,25 мM каждого dNTP; по 3 пМ праймеров HHV6F 5'-CGGATACAGTAAGACGGGATAT-3' и HHV6R 5'-ACGTAAGCTTGCACAATGC-3' и по 1,5 пМ зондов HHV6AZ НЕХ-GCAATAGATTTGGAAACGCGGCAT-BHQ1 и HHV6BZ ROX-GCAATAGATTCGGAAATGCGGCAT-BHQ2; 2,5 е.а. TaqM ДНК-полимеразы производства ООО «Компания Алкор Био» и 5 мкл ДНК, выделенной из 192 клинических образцов, содержащих ВГЧ-6. Для контроля использовали ДНК ВГЧ-6А и ВГЧ-6В (положительные контроли). ПЦР проводили в амплификаторе Bio-Rad CFX96, США в следующих условиях: «горячий старт» в течение 15 мин при 95°C; 45 циклов в режиме 95°C - 10 сек, 60°C - 20 сек со считыванием сигналов флуоресценции по каналам HEX(F1) и ROX(F2). Последующий анализ флуоресцентных кривых проводили с использованием программного обеспечения амплификатора. Экспоненциальное накопление сигнала флуоресценции с 30-го цикла амплификации по каналу HEX регистрировали только в положительном контрольном образце, содержащем ДНК ВГЧ-6А; по каналу ROX - с 25 по 35 циклы в положительном контрольном образце (ВГЧ-6В) и в 192 клинических образцах, что свидетельствовало о присутствии ДНК ВГЧ-6В.

Таким образом, представленные результаты показывают, что предлагаемый способ позволяет достоверно определять ВГЧ-6А и ВГЧ-6В.