Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ГИПЕРТЕНЗИИ МАЛОГО КРУГА КРОВООБРАЩЕНИЯ

Предполагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной хирургии, патофизиологии, кардиологии, пульмонологии и может быть использовано для моделирования гипертензии малого круга кровообращения, характеризующейся стойким нарушением функции внешнего дыхания, увеличением давления в легочной артерии, развитием гипертрофии правых отделов сердца.

Известно, что обструкция внешних дыхательных путей, в частности стеноза трахеи - вследствие инородного тела, ожога, длительной интубации и т.п., вызывает нарушение внешнего дыхания, одним из осложнений которых является формирование гипертензии малого круга кровообращения с развитием острого, либо хронического легочного сердца (Внутренние болезни. В 10 книгах. Книга 5. Пер. с англ./ Под ред. Е. Браунвальда, К.Дж. Иссельбахера, Р.Г. Петерсдорфаидр. / М.: Медицина 1995, С. 311-323).

Известен способ моделирования гипертонии в легочной артерии путем тромбоэмболии (Пат. 2075110 Российская Федерация, МПК⁶ G01N 23/28. Способ моделирования гипертонии в легочной артерии / Тявокин В.В., Инчина В.И., Зорькина А.В.; заявитель и патентообладатель: Мордовский гос. университет им. Н.П. Огарева. - №93046010/14; заявл. 29.09.1993; опубл. 10.03.1997). Известный способ осуществляют следующим образом: половозрелых кроликов весом 1,9-2,5 кг подвергают воздействию гиподинамии в течение 7-60 суток путем помещения в специальные клетки. Это ведет к тромбоэмболии легочной артерии экспериментальных животных.

К недостаткам данного способа следует отнести невозможность получения модели гипертензии малого круга кровообращения, приближенной к ее клиническому течению. Так же к недостаткам известного способа следует отнести большие различия в сроках получения модели, что свидетельствует о невозможности получения единообразных результатов из-за различного течения тромбоэмболии.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ моделирования гипертензии малого круга кровообращения на экспериментальном животном - крысе (Экспериментальное моделирование тромбоэмболии легочной артерии / Амосов В.И., Золотницкая В.П., Власов Т.Д., Литвинов А.П./ Регионарное кровообращение и микроциркуляция. СПб, 2003, №3 (7) с. 54-57).

Известный способ осуществляют следующим образом. В качестве экспериментальных животных используют беспородных крыс. Предварительно проводят перфузионную сцинтиграфию Тс-99 м-микросферами, по данным которой оценивают состояния микроциркуляции легких у конкретного животного. Далее in vitro из аутокрови животного получают микроэмболы. Через 48 после сцинтиграфии тромбоэмболы через иглу вводят в бедренную вену. Для определения выключенной реперфузии, при острой эмболии легочной артерии, вводят радиофармпрепарат с последующей визуальной и автоматической обработкой результатов исследования. Для точной локализации микроэмболов выполняют микроангиографическое исследование легких. В заключении выполняют забор гистологического материала.

К недостаткам данного способа следует отнести то, что известный способ не предусматривает возможности получения модели гипертензии малого круга кровообращения и не соответствует клиническому течению стеноза трахеи. Из-за высокого риска летальности от тромбоэмболии известный способ не может быть использован для выполнения хронического эксперимента.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа моделирования гипертензии малого круга кровообращения, приближенного к клиническому течению.

Техническим результатом предлагаемого способа является получение модели гипертензии малого круга кровообращения, характеризующейся признаками клинического течения - гипертрофией правого желудочка, увеличением массы миокарда правого желудочка, увеличением давления в правом желудочке, а так же получение стандартизированных результатов по клиническому течению и срокам развития заболевания.

Технический результат достигается тем, что способ моделирования гипертензии малого круга кровообращения проводят на экспериментальном животном - крысе.

Отличием предлагаемого способа от известного является использование в качестве экспериментальных животных самцов крыс линии Wistar в возрасте 10-12 месяцев.

Основными отличительными приемами предлагаемого способа от известного является то, что проводят трахеотомию по срединной линии ниже перешейка щитовидной железы, через межкольцевую связку, после чего в просвет трахеи вводят силиконовую трубку длиной 1 см, наружным диаметром 2 мм с тупыми закругленными концами.

Отличительными приемами предлагаемого способа также является и то, что верхний край силиконовой трубки сопоставляют с нижним краем трахеотомической раны, проводник удаляют, придерживая трубку, трахеотомическую рану ушивают П-образным швом через выше и нижестоящие полукольца трахеи с одномоментной фиксацией трубки к внутренней поверхности стенки трахеи.

Для этого нить проводят снаружи внутрь через мембранозную часть между 6 и 7 хрящами трахеи с выходом иглы в просвет трахеи, далее проводят иглу по верхнему краю силиконовой трубки, следующий вкол осуществляют изнутри кнаружи, через мембранозную часть передней стенки трахеи между 8 и 9 хрящами, выкол проводят на переднюю стенку трахеи. Подобную манипуляцию осуществляют и с другой стороны, только в обратном порядке.

Узел фиксируют на межхрящевом промежутке между 6 и 7 хрящами трахеи, грудино-подъязычные мышцы сопоставляют узловым швом, кожу ушивают непрерывным швом.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с ближайшим аналогом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна».

Использование в качестве экспериментальных животных крыс линии Wistar, а именно крыс-самцов в возрасте 10-12 месяцев, обусловлено тем, что у таких животных трахея хорошо выражена, поэтому оперативное вмешательство технически выполнимо.

Проведение трахеотомии по срединной линии ниже перешейка щитовидной железы, через межкольцевую связку, обеспечивает возможность безопасного рассечения трахеи без повреждения сосудов и ткани щитовидной железы.

Введение силиконовой трубки и ее фиксация в просвете трахеи обеспечивает устойчивое нарушение функции внешнего дыхания, вследствие чего развивается гипертензия малого круга кровообращения, гипертрофия и дилатация правых отделов сердца.

Фиксация верхнего края силиконовой трубки с нижнем краем трахеотомической раны П-образным швом через выше и нижестоящие кольца трахеи, позволяет исключить смещение трубки в просвете трахеи, а так же и обтурацию бронха трубкой, откашливание трубки.

Размещение трубки внутри трахеи исключает попадание в трубку инородных предметов (опилки, комочки еды), что снижает риск аспирации, инфицирования трахеи и легких, а так же и выгрызание трубки животным.

Подбор животных по половому и возрастному критерию позволяет стандартизировать получаемые результаты.

Экспериментальными исследованиями авторов заявляемого способа установлена оптимальная длина силиконовой трубки - 1 см., ее наружный диаметр - 2 мм, внутренний диаметр (просвет) - 1 мм. Такие параметры трубки сужают просвет трахеи на 58,3% от исходного, в то же время внутренний просвет трубки соответствует 41,7% просвета трахеи крысы, т.к. средний диаметр просвета трахеи крысы равен 2,4 (2,2-2,5) мм.

Экспериментами установлено, что сужение просвета на 58,3% приводит к нарушению внешнего дыхания - в виде появление постороннего звука «свистящего дыхания» и увеличению его частоты. Гистологические исследования подтвердили нарушение репаративных процессов в трахее - развитие продуктивного воспаления и образование коллагеновых волокон к 7 суткам исследования; на препаратах миокарда - отек стромы, увеличение размера ядер кардиомиоцитов, дистрофические изменения в миокарде. При выполнении раздельного взвешивания миокарда отмечено достоверное увеличение массы миокарда правого желудочка (P_U=0,005).

К 14 суткам эксперимента по сужению просвета трахеи выявлено увеличение давления в правом желудочке сердца крыс (P_U=0,005) и, соответственно, увеличение давления в легочной артерии.

Заявляемый способ позволяет получить высоко воспроизводимую модель гипертензии малого круга кровообращения, характеризующуюся стойким нарушением функции внешнего дыхания, увеличением давления в легочной артерии, развитием гипертрофии правых отделов сердца при отсутствии летальности экспериментальных животных.

Экспериментальная модель может быть использована при проведении хронического эксперимента, т.к. животные самостоятельно не могут удалить трубку, трубка не обтурируется мокротой, поскольку животное свободно откашливает мокроту через нее, животное свободно питается. Вследствие отсутствия связи трубки непосредственно с окружающей средой отсутствует риск аспирации пищи или подстила и отсутствует риск асфиксии.

В доступной литературе отсутствуют сведения о способе моделирования гипертензии малого круга кровообращения по отличительным признакам заявляемого способа, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в экспериментальной медицине и патофизиологии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами, следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию патентоспособности «промышленная применимость».

Заявляемый способ осуществляют следующим образом:

Экспериментальных животных крыс-самцов линии Wistar, возраста 10-12 месяцев, массой тела 300-350 г, после обезболивания фиксируют на столике А.И Сеченова в положении на спине. На левой половине вентральной поверхности шеи ножницами выстригают шерсть, кожу обрабатывают антисептиком. Затем проводят угловой разрез кожи с формированием косынкообразного лоскута, угол которого обращен к левой боковой поверхности шеи. Кожный лоскут отпрепаровывают и отводят на зажиме вправо. Попеременно тупым и острым путем, используя ножницы и пинцет, мобилизуют слюнные железы в бессосудистой зоне. Грудино-подъязычные мышцы тупым путем разделяют по срединной линии и отводят на держалках в верхней и нижней третях в противоположные стороны. Визуализируют гортань, трахею и щитовидную железу. Между 7 и 8 полукольцами трахеи, на 3 хрящевых полукольца ниже перешейка щитовидной железы, по срединной линии, через межкольцевую связку, полой острой иглой (r 0,7 мм) выполняют трахеотомию. Полученное отверстие при помощи микрохирургических инструментов (пинцет, ножницы) расширяют в поперечном направлении (в обе стороны) по межкольцевой связке до 1/3 просвета трахеи. Далее по полужесткому проводнику в просвет трахеи вводят силиконовую трубку с тупыми закругленными концами. Длина трубки составляет 1 см, наружный диаметр - 2 мм, внутренний диаметр - 1 мм. Верхний край введенной трубки сопоставляют с нижним краем трахеотомической раны, проводник удаляют. Придерживая трубку 5, трахеотомическую рану ушивают П-образным швом через выше и нижестоящие полукольца трахеи с одномоментной фиксацией трубки к внутренней поверхности стенки трахеи. Для этого нить проводят снаружи внутрь через мембранозную часть между 6 и 7 хрящами трахеи, с выходом иглы в просвет трахеи, далее проводят иглу по верхнему краю силиконовой трубки. Следующий вкол осуществляют изнутри кнаружи, через мембранозную часть передней стенки трахеи между 8 и 9 хрящами, выкол проводят на переднюю стенку трахеи. Подобную манипуляцию осуществляют и с другой стороны, только в обратном порядке. Узел фиксируют на межхрящевом промежутке между 6 и 7 хрящами трахеи. Грудино-подъязычные мышцы сопоставляют узловым швом. Кожу ушивают непрерывным швом. В результате трубка размещена в просвете трахеи, верхний конец трубки зафиксирован.

Предлагаемый способ поясняется примером конкретного выполнения.

Исследование проведено на 36 белых крысах-самцах линии «Wistar», 10-12 месячного возраста, с массой тела 300-350 г.

Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище, что соответствует нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ» (виварий I категории, вет. удостоверение 238 №000360 от 30 апреля 2013 г., служба ветеринарии Иркутской области) по утвержденным СОП (Лепехова С.А. Программа стандартных операционных процедур: лабораторные животные (прием, содержание, уход и контроль здоровья животных в вивариях медицинского учреждения): учеб. пособие) / С.А. Лепехова. - Иркутск: НЦРВХ СО РАМН; ИГМУ, 2012. - С. 7-32).

Опыты на животных выполняли в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, регламентированными «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными Приказом МЗ СССР №742 от 13.11.84 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и №48 от 23.01.85 г.

«О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных».

Методом рандомизации животные были распределены на 2 группы:

№1 (n=24) опытная группа с моделированием гипертензии малого круга кровообращения по заявленному способу;

№2 (n=12) группа здоровых животных, содержащихся в условиях, одинаковых с экспериментальными.

Животных 1 группы (по n=6) выводили из эксперимента на 3, 7 и 14 сутки для выполнения гистологических исследований органокомплексов в зоне операции и сердца. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. На 14 сутки эксперимента у оставшихся 6-ти животных (n=6) измеряли давление в правом желудочке сердца, проводили раздельное взвешивание и измерение толщины миокарда.

За норму были приняты показатели, полученные у двенадцати здоровых животных группы №2, которым также измеряли давление в правом желудочке сердца, проводили раздельное взвешивание миокарда, измерение толщины миокарда (n=6) и гистологическое исследование органокомплекса трахеи и сердца (n=6). Препараты окрашивали гематоксилином и эозином.

Статистический анализ проведен при помощи непараметрических тестов с использованием пакета программ Statistika 10.0 (номер лицензии AXAR402G263414FA-V). Данные представляли в виде медианы с нижним и верхним квартилями (25-й и 75-й процентили), определение значимости различий, полученных данных (Р) в сравниваемых выборках проведено по критерию Манна-Уитни (u). (Гланц С. Медико-биологическая статистика: пер. с англ. / С. Гланц - М.: Практика, 1998. - С. 327-337).

Морфологическая структура миокарда правого желудочка сердца контрольной группы животных представлены на фиг. 1 (ув. 80х.) и фиг. 2 (ув. 100х), где 1 - ядро кардиомиоцита, 2 - строма. Окраска этих препаратов проведена гематоксилином и эозином.

На 14 сутки эксперимента у животных первой (опытной) группы выявлены значительные изменения в миокарде правого желудочка сердца. Так в миокарде отмечается гипертрофия стенки желудочка (фиг. 3 ув. 80х) и выявлено увеличение ядер кардиомиоцитов 1, отек стромы миокарда 2 (фиг. 4 ув. 200х). Окраска гематоксилином и эозином.

Для выявления гипертрофии миокарда было выполнено раздельное взвешивание и измерение его толщины на 14 сутки эксперимента, как у здоровых животных (группа 2), так и в опытной группе №1 после сужения просвета трахеи. Взвешивание выполняли на электронных весах Adventure AR 3130 (свидетельство о поверке №58767-110-708 от 17.12.2015), измерение толщины миокарда проводили штангенциркулем (сертификат о калибровке №14923).

По результатам исследования вес сердца животных группы 2 составлял 1,182 (1,134-1,22), правого желудочка 0, 174 (0,17-0,182) грамма. Толщина миокарда правого желудочка 1,1(1-1,1) мм.

При выведении животных группы 1 на 14 сутки эксперимента вес сердца животных составлял 1,376 (1,31-1,392) грамма, правого желудочка 0,281 (0,267-0,287) грамм. Толщина миокарда правого желудочка 1,8 (1,8-1,9) мм.

При выполнении статистического анализа полученных результатов достоверных различий в массе сердца здоровых и экспериментальных животных выявлено не было (P_U=0,064), при этом отмечены достоверные различия в массе (P_U=0,005) и в толщине миокарда правого желудочка (P_U=0,004). Следовательно, полученные результаты свидетельствуют о достоверном увеличении массы и утолщении миокарда правого желудочка.

Для оценки давления в правых отделах сердца использовали метод прямого измерения давления в правом желудочке. Измерение давления выполняли под общей анестезией. Животных фиксировали на столике Сеченова, выполняли боковую торакотомию, в полость правого желудочка вводили инъекционную иглу (0,6×32) заполненную физиологическим раствором с гепарином, систолическое давление фиксировали с использованием хирургического аппарата полиграф «Салют».

По результатам исследования установлено, что давление в правом желудочке у животных группы 2 (контроль) в систолу составляет 25 (24-26) мм рт.ст., а у животных группы 1 (опыт) - 46,5 (46-48) мм рт.ст. При сравнительном анализе этого показателя в группах выявлены достоверные различия (P_U=0,005). Следовательно, выявлено увеличение давления в правом желудочке крыс после моделирования сужения просвета трахеи к 14 суткам эксперимента. С увеличением давления в правом желудочке, соответственно, увеличивается давление в легочной артерии.

Полученные данные по увеличению массы миокарда, по утолщению правого желудочка, а также по увеличению давления в правом желудочке свидетельствуют о наличии гипертензии малого круга кровообращения к 14 суткам эксперимента.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить модель гипертензии малого круга кровообращения, характеризующуюся признаками клинического течения - гипертрофией правых отделов сердца, увеличением массы миокарда правого желудочка, увеличением давления в правом желудочке, что дает возможность изучения как механизмов развития нарушения функций внешнего дыхания и гемодинамики, так и их коррекции.

Получаемая модель легко воспроизводима, может быть использована при проведении хронического эксперимента. Летальность экспериментальных животных отсутствует.