СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ СЕНСОНЕВРАЛЬНОЙ ТУГОУХОСТИ

Изобретение относится к области медицины, а именно к оториноларингологии, и может быть использовано для моделирования сенсоневральной тугоухости, вызванной акустическим воздействием широкополосного шума.

Проблема сенсоневральной тугоухости (СНТ) остается актуальной в современной оториноларингологии. В России больные с нарушениями слуха составляют 2-10% населения с преобладанием СНТ: нарушение звуковосприятия встречается в 63,2-80% случаев (Таварткиладзе Г.А., Загорянская М.Е., Румянцева М.Г. и др. Методики эпидемиологического исследования нарушений слуха. Метод. Рекомендации. - М., 2006 - 21 с.; Кунельская Н.Л., Скрябина Л.Ю. Нарушение слуха у лиц молодого возраста // Вестник оториноларингологии. - 2014. - №1. - С. 24-28), а по данным ЛОР кафедры Ростовского государственного медицинского университета СНТ в структуре тугоухости составляет 80,4% случаев (Золотова Т.В. Сенсоневральная тугоухость. Ростов-на-Дону: ЗАО «Книга», 2013 - с. 10-12). СНТ обычно проявляется снижением слуха по звуковоспринимающему типу и субъективным шумом в ушах. Нарушение слуховой функции вызывает социальную изоляцию, когнитивные расстройства, депрессии. Неуклонное увеличение заболеваемости СНТ во многом обусловлено чрезмерными звуковыми воздействиями раздражителей окружающей среды: гул моторов на улице, шумовые воздействия на производстве, шум от бытовых приборов дома, и, так называемые, рекреационные воздействия, такие как шум и музыка в клубах, барах, дискотеках, тренажерных залах. По данным A.C.Y. Wong и соавт. только в Великобритании приблизительно 2/3 людей в возрасте 18-30 лет подвержены опасному высокоинтенсивному звуковому воздействию, более 85 дБ, которое может вызвать нарушение слуха (Wong A.C.Y., Froud K.Е., Hsieh Y.S.Y. Noise-induced hearing loss in the 21st century: A research and translational update // World Journal of Otorhinolaryngology. - 2013. - V. 3, N. 3. - P. 58-70). В России значительную часть больных СНТ составляют лица трудоспособного возраста, при этом около 4 млн работников пребывают в условиях высоких уровней производственного шума (Панкова В.Б. Новые проблемы сенсоневральной тугоухости - новые решения // Материалы 19 съезда оториноларингологов России - ООО «Полифорум», СПб, 2016 - С. 329-330). Все это подтверждает социальную значимость проблемы и необходимость поиска методов лечения и профилактики тугоухости, поэтому изучение механизмов возникновения СНТ в эксперименте на животных с целью последующего патогенетического лечения является чрезвычайно важной задачей современной оториноларингологии.

Проведенными исследованиями по научно-медицинской и патентной литературе выявлены различные способы моделирования сенсоневральной тугоухости.

Так, L. Afzelius, J. Aursness предложили способ моделирования СНТ, предусматривающий перевязку передней нижней мозжечковой артерии у экспериментальных животных - 41 морской свинки (Structural changes in the organ of Corti of the guinea Pig after obstruction of arterial blad flow to the inner ear // Acta otolaryngol. - 1979. - V. 104 (№3-4). - P. 202-210).

Недостатками данного способа являются его сложность, инвазивность и необходимость хирургической подготовки исследователя, недостаточная воспроизводимость (53,7%) морфологической основы патологии.

Патентом РФ №2222054 (опубл. 20.01.2004) защищен "Способ моделирования сенсоневральной тугоухости". Экспериментальное животное - крысу, первые 2 недели по 3 часа ежедневно обездвиживают в одноместном крысином "домике". В последующие 2 недели ежедневно в течение 1 часа животное обездвиживают и одновременно вводят внутримышечно ототоксический антибиотик - гентамицин. Одноразовая доза гентамицина - 20 мг/кг массы животного.

Недостатками данного способа являются длительность эксперимента - 1 месяц, инвазивность методики - внутримышечное введение ототоксического препарата.

В работе А.А. Паневина (Слуховосстанавливающий эффект N-сукцинил-хитозана в условиях модели острого акустического субповреждающего воздействия // Российская оториноларингология - 2015- №3(76). - С. 108) описан способ моделирования СНТ, вызванной интенсивным акустическим воздействием на экспериментальное животное - самцы крыс, линия Wistar, вес 200-250 г. Тональный сигнал частотой 5 кГц при уровне звука 110-112 дБ подается непрерывно в течение 2 часов в свободном звуковом поле.

Недостатками данного способа являются: отсутствие достижения стойкой потери слуха; кратковременность реализации модели СНТ: на 7 сутки после однократной двухчасовой акустической стимуляции у всех подопытных животных восстановилась функциональная активность слухового рецептора; чрезмерное однократное воздействие на внутреннее ухо тональным звуком значительной интенсивности - 110-112 дБ, вызывающим острую акутравму; использование тонального стимула, который реже, чем шум встречается на производстве и в быту; высокая себестоимость модели в связи с использованием дорогостоящих животных линии Wistar.

Китайские ученые Y. Liang, S. Zhang, X. Zhang (Effect of sildenafil on morphology to noise-induced hearing loss in guinea pigs // Journal of clinical oto-rhinolaryngology, head, and neck surgery. - 2015. - Jul., 29(13). - P. 1216-20) использовали способ моделирования СНТ, вызванной воздействием белого шума на экспериментальное животное: морских свинок подвергали однократной экспозиции белого шума при уровне звука 110 дБ. По данным слуховых вызванных потенциалов результаты оценивали до эксперимента, через 1 неделю после экспозиции шума, констатируя значительные сдвиги слуховых порогов, а в группе с применением лечения - через 1, 2, 4 недели после введения лекарства. Патологические изменения в нейроэпителиальных - волосковых клетках улитки определяли с помощью световой и сканирующей электронной микроскопии.

Недостатками данного способа являются: чрезмерное однократное воздействие на внутреннее ухо белым шумом значительной интенсивности – 110 дБ, вызывающим острую акутравму; анатомическое несоответствие строения улитки внутреннего уха морской свинки и человека.

Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является описанный в работе Н.Н. Петровой (Проблемы профессиональной сенсоневральной тугоухости // Автореф. дис. …д-ра мед. наук - СПб. - 2010. - с. 15) способ моделирования СНТ, предусматривающий акустическое воздействие широкополосным шумом и вибрацией на подопытных животных - 65 морских свинок массой 250-400 г. Каждое подопытное животное для моделирования шумовибрационной тугоухости помещали на вибростенд и подвергали воздействию вибрации и, генерируемого вибростендом, широкополосного шума с уровнем звука 85 дБ в течение четырех недель по 3 часа в день. Состояние слуховой функции у животных оценивали после действия производственного фактора.

Недостатками прототипа являются отдаленность модели от воспроизводимой патологии из-за анатомического несоответствия строения улитки морской свинки и человека; слишком большие сроки для воспроизведения сенсоневральной тугоухости - 4 недели; сложность - необходимость наличия специального вибростенда и специалиста, его обслуживающего, а также ограниченные функциональные возможности способа - моделирование СНТ, обусловленной только лишь воздействием комбинированного шумовибрационного фактора.

Задачей предложенного изобретения является разработка простого, эффективного, достоверного и недорогого способа моделирования СНТ, вызванной акустическим воздействием широкополосного шума.

Техническим результатом, объективно проявляющимся при осуществлении предлагаемого способа, является упрощение способа и сокращение времени воспроизведения модели сенсоневральной тугоухости.

Технический результат достигается путем акустического воздействия широкополосным шумом на подопытное животное - белую беспородную крысу, которую в течение 10 дней ежедневно 1 раз в сутки обездвиживают и через 30 минут подвергают акустическому воздействие широкополосным шумом в течение 15 минут, после чего иммобилизацию – обездвиживание, подопытного животного прекращают.

Подробное описание способа

Подопытное животное - белую беспородную крысу, в течение 10 дней ежедневно 1 раз в сутки обездвиживают, помещая в одноместный крысиный "домик" (патент РФ №2222054 "Способ моделирования сенсоневральной тугоухости", опубл. 20.01.2004). Через 30 минут, не удаляя подопытное животное из клетки, его подвергают акустическому воздействие широкополосным шумом в течение 15 минут. После окончания акустического воздействия иммобилизацию подопытного животного прекращают и подопытное животное пересаживают в общую просторную клетку.

Акустическое воздействие широкополосным шумом выполняют в частотном диапазоне 355-5000 Гц при уровне звука 85-90 дБ с помощью, например, звукореактотеста модели ЗРТ-01 («Ритм», г. Москва) в свободном звуковом поле. Уровень звука измеряют с помощью, например, цифрового измерителя уровня звука типа AR 824, производства НТУ «АРК Энергосервис» (г. Санкт-Петербург, Россия).

Для подтверждения реализации модели СНТ на 11 день эксперимента сначала проводят оценку слуховой функции подопытного животного с помощью исследования отоакустической эмиссии (ОАЭ), после чего животное обезболивают и умерщвляют в строгом соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Готовят гиотологические препараты с окраской гематоксилин-эозином и проводят морфологическое исследование срезов улитки.

Оценку слуховой функции подопытного животного (каждого уха) выполняют с помощью, например, портативной системы регистрации ОАЭ «OtoRead», фирмы Interacoustics (Дания). Подбирается ушной вкладыш соответствующего диаметра для обеспечения герметической обтурации наружного слухового прохода. В наружный слуховой проход подопытного животного вводится зонд прибора, на кончике которого устанавливается подобранный вкладыш, и проводится исследование. Результат исследования задержанной вызванной отоакустической эмиссии (ЗВОАЭ) - "ТЕСТ ПРОШЕЛ" - свидетельствует о нормальном слухе, а результат - "ТЕСТ НЕ ПРОШЕЛ" - подтверждает наличие СНТ у подопытного животного.

Наличие в гистологических препаратах улиток височных костей белых крыс признаков повреждений элементов спирального - Кортиева, органа (Пальчун В.Т., Крюков А.И.. Оториноларингология: Руководство для врачей. Часть 1.- М:«Медицина», 2001. - с. 99): дистрофические изменения и разрушения нейроэпителиальных клеток спирального органа, дистрофические изменения поддерживающих клеток, их отсутствие в отдельных участках спирального органа - гибель клеток, деформация и нарушение целостности базилярной мембраны, деформация и разрыв вестибулярной мембраны, нарушение архитектоники и отек спиральной связки; отек сосудистой полоски; деформация или отсутствие покровной мембраны в сравнении с контролем, свидетельствует о развитии СНТ (Золотова Т.В. Сенсоневральная тугоухость. Ростов-на-Дону: ЗАО «Книга», 2013 - с. 10-12) у подопытного животного.

Таким образом, о реализации модели СНТ судят по итогам двух достоверных и объективных методов исследования: функциональном - исследование отоакустической эмиссии и морфологическом - изучение нарушений анатомических структур спирального органа улитки подопытного животного на гистологических препаратах.

Практическая реализуемость предложенного способа иллюстрируется следующим примером.

Пример 1: подопытному животному - белой беспородной крысе весом 220 г в возрасте 2 мес, предварительно провели оценку слуховой функции путем исследования ЗВОАЭ с помощью портативной системы регистрации отоакустической эмиссии «OtoRead» фирмы Interacoustics (Дания). Подобрали ушной вкладыш соответствующего диаметра для обеспечения герметической обтурации наружного слухового прохода, затем в наружный слуховой проход подопытного животного ввели зонд прибора, на кончике которого был установлен подобранный вкладыш, и провели исследование. Имел место результат ЗВОАЭ - "ТЕСТ ПРОШЕЛ", что свидетельствовало о нормальном слухе.

Затем подопытное животное в течение 10 дней ежедневно 1 раз в сутки обездвиживали, помещая в одноместный крысиный "домик" (патент РФ №2222054 "Способ моделирования сенсоневральной тугоухости", опубл. 20.01.2004). Через 30 минут после начала обездвиживания, не удаляя подопытное животное из клетки, его подвергали акустическому воздействию широкополосным шумом в течение 15 минут. После окончания акустического воздействия иммобилизацию подопытного животного прекращали, и подопытное животное пересаживали в общую просторную клетку.

Акустическое воздействие широкополосным шумом выполняли в частотном диапазоне 355-5000 Гц при уровне звука 90 дБ с помощью звукореактотеста модели ЗРТ-01 (производство - «Ритм», г. Москва) в свободном звуковом поле. Уровень звука измеряли с помощью цифрового измерителя уровня звука типа AR 824, производства НТУ «АРК Энергосервис» (г. Санкт-Петербург, Россия).

На 11 день эксперимента вновь провели оценку слуховой функции каждого уха подопытного животного путем регистрации ЗВОАЭ. В наружный слуховой проход подопытного животного ввели зонд прибора, на кончике которого установлен подобранный вкладыш, и провели исследование. Имел место следующий результат при исследовании ЗВОАЭ: "ТЕСТ НЕ ПРОШЕЛ", что свидетельствовало о развитии у подопытного животного СНТ.

После этого животное обезболили и умертвили в строгом соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Приготовили гистологические препараты с окраской гематоксилин-эозином и провели морфологическое исследование срезов улитки: имели место дистрофические изменения и разрушения нейроэпителиальных клеток спирального органа; дистрофические изменения поддерживающих клеток и их отсутствие в отдельных участках спирального органа - гибель клеток; деформация базилярной мембраны; деформация и разрыв вестибулярной мембраны; нарушение архитектоники и отек спиральной связки; отек сосудистой полоски; отсутствие покровной мембраны. Все перечисленные дистрофические и деструктивные изменения структур спирального органа, определяемые на гистологическом препарате, свидетельствуют о развитии СНТ у подопытного животного.

Таким образом, результаты двух достоверных и объективных методов исследования: функционального - исследование отоакустической эмиссии и морфологического - изучение нарушений гистологических структур слухового аппарата подопытного животного, подтвердили развитие у подопытного животного СНТ, т.е. свидетельствовали о реализации модели СНТ.

Пример 2: подопытному животному - белой беспородной крысе, весом 240 г, в возрасте 2,5 мес предварительно провели оценку слуховой функции путем исследования ЗВОАЭ с помощью портативной системы регистрации отоакустической эмиссии «OtoRead» фирмы Interacoustics (Дания). Подобрали ушной вкладыш соответствующего диаметра для обеспечения герметической обтурации наружного слухового прохода, затем в наружный слуховой проход подопытного животного ввели зонд прибора, на кончике которого был установлен подобранный вкладыш, и провели исследование. Имел место результат ЗВОАЭ - "ТЕСТ ПРОШЕЛ", что свидетельствовало о нормальном слухе.

Затем подопытное животное в течение 10 дней ежедневно 1 раз в сутки обездвиживали, помещая в одноместный крысиный "домик" (патент РФ №2222054 "Способ моделирования сенсоневральной тугоухости", опубл. 20.01.2004). Через 30 минут после начала обездвиживания, не удаляя подопытное животное из клетки, его подвергали акустическому воздействию широкополосным шумом в течение 15 минут. После окончания акустического воздействия иммобилизацию подопытного животного прекращали, и подопытное животное пересаживали в общую просторную клетку.

Акустическое воздействие широкополосным шумом выполняли в частотном диапазоне 355-5000 Гц при уровне звука 85 дБ с помощью звуко-реактотеста модели ЗРТ-01 (производство - «Ритм», г. Москва) в свободном звуковом поле. Уровень звука измеряли с помощью цифрового измерителя уровня звука типа AR 824, производства НТУ «АРК Энергосервис» (г. Санкт-Петербург, Россия).

На 11 день эксперимента сначала провели оценку слуховой функции (каждого уха) подопытного животного путем регистрации ЗВОАЭ, которую выполняли с помощью портативной системы регистрации ОАЭ «OtoRead» фирмы Interacoustics (Дания). Подобрали ушной вкладыш соответствующего диаметра для обеспечения герметической обтурации наружного слухового прохода, затем в наружный слуховой проход подопытного животного ввели зонд прибора, на кончике которого установлен подобранный вкладыш, и провели исследование. Имел место следующий результат при исследовании ЗВОАЭ: "ТЕСТ НЕ ПРОШЕЛ", что свидетельствовало о развитии у подопытного животного СНТ.

После этого животное обезболили и умертвили в строгом соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Приготовили гистологические препараты с окраской гематоксилин - эозином и провели морфологическое исследование срезов улитки; имели место дистрофические изменения и разрушения нейроэпителиальных клеток спирального органа, дистрофические изменения поддерживающих клеток и их отсутствие в отдельных участках спирального органа - гибель клеток, деформация и нарушение целостности базилярной мембраны, деформация вестибулярной мембраны, отек спиральной связки; отек сосудистой полоски; отсутствие покровной мембраны. Все перечисленные дистрофические и деструктивные изменения структур спирального органа, определяемые на гистологическом препарате, свидетельствуют о развитии СНТ у подопытного животного.

Таким образом, результаты двух достоверных и объективных методов исследования: функционального - исследование отоакустической эмиссии и морфологического - изучение нарушений гистологических структур слухового аппарата подопытного животного, подтвердили развитие у подопытного животного СНТ, т.е. свидетельствовали о реализации модели СНТ.

Для разработки заявляемого способа на кафедре болезней уха, горла, носа Ростовского государственного медицинского университета (Рост ГМУ) было исследовано 34 подопытных животных (68 ушей) - белые беспородные крысы в возрасте 2-3 месяцев.

Предварительно у всех подопытных животных провели оценку слуховой функции (68 ушей) путем регистрации ЗВОАЭ с помощью портативной системы регистрации отоакустической эмиссии «OtoRead» фирмы Interacoustics (Дания). Во всех случаях для каждого уха имел место результат - "ТЕСТ ПРОШЕЛ", что свидетельствовало о нормальном слухе у всех 34 подопытных животных (68 ушей).

Все крысы были разделены на 2 группы: основную группу - 20 крыс и группу контроля - 14 крыс.

Каждое из 20 подопытных животных основной группы в течение 10 суток ежедневно 1 раз в день до еды подвергали деструктивному воздействию: сначала каждое животное обездвиживали, помещая его в одноместный крысиный домик (патент РФ №2222054 "Способ моделирования сенсоневральной тугоухости", опубл. 20.01.2004). Через 30 минут после начала обездвиживания, не удаляя подопытное животное из клетки, в течение 15 минут подвергали акустическому воздействию широкополосным шумом с параметрами: частотный диапазон 355-5000 Гц, интенсивность звука - 85-90 дБ. После окончания акустического воздействия иммобилизацию подопытного животного прекращали, и крысу пересаживали в общую просторную клетку.

14 крыс группы контроля такому деструктивному воздействию не подвергали.

На 11 день эксперимента провели оценку слуховой функции 20 подопытных животных основной группы и 14 - группы контроля с помощью исследования ЗВОАЭ на портативной системе регистрации отоакустической эмиссии «OtoRead», фирмы Interacoustics (Дания).

Результаты исследования группы контроля: у всех 14 крыс (28 ушей) имел место результат регистрации ЗВОАЭ - "ТЕСТ ПРОШЕЛ", что свидетельствовало о нормальном слухе у всех крыс группы контроля.

Результаты исследования основной группы: у всех 20 крыс (40 ушей) имел место результат регистрации ЗВОАЭ - "ТЕСТ НЕ ПРОШЕЛ", что свидетельствовало о развитии СНТ у всех 20 подопытных животных основной группы.

Затем все 20 крыс основной группы были обезболены и умерщвлены в строгом соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Были приготовлены гистологические препараты с окраской гематоксилин - эозином и проведено морфологическое исследование срезов улиток 40 ушей.

Абсолютно во всех гистологических препаратах тканей улиток имели имели место дистрофические изменения и разрушения нейроэпителиальных клеток спирального органа, дистрофические изменения поддерживающих клеток, их отсутствие в отдельных участках спирального органа - гибель клеток, деформация и нарушение целостности базилярной мембраны, деформация и разрыв вестибулярной мембраны, нарушение архитектоники и отек спиральной связки; отек сосудистой полоски; деформация или в ряде препаратов - отсутствие покровной мембраны в связи с ее разрушением, что свидетельствовало о повреждениях клеточных и мембранных структур спирального органа у всех 20 подопытных животных основной группы, что также подтверждало развитие СНТ у подопытных животных.

Таким образом, результаты двух достоверных, объективных методов исследования: функционального - исследование отоакустической эмиссии и морфологического - изучение нарушений гистологических структур слухового аппарата улитки подопытных животных, свидетельствовало о развитии СНТ у всех 20 подопытных животных основной группы, т.е. о реализации модели.

На фиг. 1 представлена микрофотография гистологического препарата спирального органа улитки одной из крыс контрольной группы, где позиция 1 - нейроэпителиальные - волосковые, клетки спирального органа; позиция 2 - поддерживающие клетки спирального органа; позиция 3 - базилярная мембрана; позиция 4 - вестибулярная мембрана; позиция 5 - спиральная связка; позиция 6 - сосудистая полоска; позиция 7 - покровная мембрана.

Как видно из фиг. 1, все перечисленные структуры спирального органа сохраняют свою целостность и упорядоченность, соответствуя нормальному строению спирального органа улитки, что подтверждает отсутствие нарушений слуха у крысы контрольной группы.

На фиг. 2 представлена микрофотография гистологического препарата спирального органа улитки одной из крыс основной группы. Как видно из фиг.2, нейроэпителиальные клетки спирального органа 1 дистрофически изменены, разрушены, клеточные ряды не прослеживаются; поддерживающие клетки спирального органа 2 дислоцированы, отсутствуют в наружной части спирального органа - гибель клеток; базилярная мембрана 3 деформирована, разорвана; вестибулярная мембрана 4 деформирована и разорвана; в спиральной связке 5 - нарушение архитектоники и отек; в сосудистой полоске 6 - признаки отека; покровная мембрана 7 отсутствует. Все перечисленные дистрофические и деструктивные изменения структур спирального органа, определяемые на гистологическом препарате, свидетельствуют о развитии СНТ у подопытного животного.

Таким образом, предложенный способ прост в исполнении, позволяет в 2,8 раза сократить время реализации модели СНТ и обеспечивает адекватное воспроизведение сенсоневральной тугоухости, вызванной акустическим воздействием широкополосного шума на слуховой аппарат экспериментального животного.