Результат интеллектуальной деятельности: СРЕДСТВО ЗАЩИТЫ ПШЕНИЦЫ И ЯЧМЕНЯ ОТ ГЕЛЬМИНТОСПОРИОЗА

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, более конкретно к защите растений от грибковых заболеваний, а именно к средству защиты пшеницы и ячменя от возбудителя гельминтоспориоза Bipolaris sorokiniana, которое содержит белковый комплекс «аллиназа-лектин», выделенный из чеснока посевного Allium sativum L.

Изобретение наиболее эффективно может быть использовано в сельском хозяйстве в качестве экологически безопасного эффективного средства защиты пшеницы и ячменя от гельминтоспориоза.

Известен широкий спектр химических средств защиты растений от возбудителя гельминтоспориоза В. sorokiniana [Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных на территории Российской Федерации 2016 (www.agroxxi.ru/goshandbook) частности средства на основе производных тетрагидрофурана (например, позаконазол), триазола, веществ дитиазинанового ряда.

Известное средство на основе производных тетрагидрофурана [патент РФ №2079274 (1997)] представляет собой фунгицид широкого спектра действия и при действующей концентрации 1 г/л не обладает фитотоксичностью. Известно средство для борьбы с грибковыми заболеваниями, включающее тетрагидро-1,3,5-дитиазинин-2-тион в качестве активного вещества [патент США №3513234, 1970].

Основными недостатками химических средств борьбы с грибковой инфекцией (В. sorokiniana) являются многостадийные способы их получения с использованием труднодоступных реагентов, многокомпонентный состав, а также накопление вредных веществ в почве, водоемах и грунтовых водах при широком использовании.

В качестве альтернативы химическим пестицидам иногда применяют препараты, содержащие вещества природного происхождения, или биопрепараты, представляющие собой продукты жизнедеятельности микроорганизмов, которые угнетающе воздействуют на метаболизм фитопатогенов, например альбит или правастатин.

Известна композиция на основе хитозана с добавлением органических кислот (янтарная кислота, молочная кислота и их смесь с глутаминовой), которая представляет собой комплексное средство для борьбы с возбудителем гельминтоспориоза и используется при массовом соотношении хитозан:органическая кислота 1:1 [ патент РФ №2127056 (1999)].

Известный препарат альбит, который действует как антидот, фунгицид и регулятор роста растений, используют, в частности, и для борьбы с возбудителем гельминтоспориоза. Альбит представляет собой средство на основе поли-бета-гидроксимасляной кислоты микробного происхождения. Альбит относится к веществам 4-го класса токсичности и применяется в виде раствора концентрации 0,1-0,2 мл/л. Для более сильного воздействия на фитопатоген В. sorokiniana препарат используют совместно с другими фунгицидами.

Известный препарат правастатин, продуцируемый актиномицетом Streptomyces carbophilus, способен снижать степень зараженности растений грибом В. sorokiniana. Для борьбы с фитопатогеном используют 0,1% раствор препарата, при концентрации ниже 0,05-0,1% препарат не оказывает существенного влияния на фитопатоген В. sorokiniana. [Карташов М.И., Джавахия В.Г. Вестник защиты растений, 3, 2010; Карташов М.И., Щербакова Л.А., Дорофеева Л.Л., Джавахия В.Г. Защита и карантин растений, 2011, №4, 34-35].

Препарат правастатин, имеющий биологическое происхождение, обладающий фунгицидной активностью в отношении возбудителя гельминтоспориоза В. sorokiniana на ячмене был выбран в качестве прототипа. Недостатками прототипа являются сложный и трудоемкий способ его получения, включающий процедуру ферментации, и необходимость использования препарата в виде растворов довольно высокой концентрации.

В литературе нет сведений об использовании в сельском хозяйстве в качестве средства защиты растений от гельминтоспориоза, вызываемого фитопатогенным грибом В. sorokiniana, каких-либо веществ, выделенных из чеснока посевного Allium sativum L.

Задачей настоящего изобретения является создание достаточно эффективного и экологически безопасного средства защиты пшеницы и ячменя от гельминтоспориоза из доступного растительного сырья.

Задача решается заявляемым средством защиты пшеницы и ячменя от возбудителя гельминтоспориоза В. sorokiniana, которое содержит выделенный из чеснока посевного Allium sativum L. белковый комплекс "аллиназа-лектин" с мольным соотношением аллиназа: лектин, составляющим 1:150, причем заявляемое средство эффективно при разведении водой до концентрации общего белка 10^-15-10^-9 мг/мл, предпочтительно 10^-11 мг/мл.

Активность заявляемого средства по отношению к возбудителю гельминтоспориоза В. sorokiniana иллюстрируется фигурами 1 и 2.

На фиг. 1 демонстрируется развитие гельминтоспориоза, вызываемого В. sorokiniana, на листьях ячменя (в течение 7 суток): А1 - при совместном нанесении спор В. sorokiniana и заявляемого средства (комплекса «аллиназа-лектин» чеснока), А2 - при нанесении спор В. sorokiniana (контроль).

На фиг. 2 показано развитие гельминтоспориоза, вызываемого В. sorokiniana, на листьях пшеницы (в течение 7 суток): Б1 - при совместном нанесении спор В. sorokiniana и заявляемого средства (комплекса «аллиназа-лектин» чеснока), Б2 - нанесение спор В. sorokiniana (контроль).

Источником получения заявляемого средства защиты пшеницы и ячменя от гельминтоспориоза, поражающего растения, является водно-солевой экстракт из луковиц чеснока Allium sativum L, богатого различными биологически активными веществами. Экстракцию очищенных и измельченных луковиц чеснока проводят при пониженной температуре 4°С, что позволяет устранить неспецифический протеолиз белков. Добавление к экстракту сульфата аммония приводит к осаждению крупных белков, включая требуемый комплекс «аллиназа-лектин».

Из белкового осадка, образовавшегося после обработки экстракта сульфатом аммония, с помощью гель-проникающей высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) выделяют комплекс лектина чеснока с молекулярной массой 6400 Да и аллиназы чеснока с молекулярной массой 54000 Да. Мольное соотношение аллиназа:лектин в комплексе составляет 1:150, а массовое соотношение - приблизительно 1:18 (Следует отметить, что в литературе описан комплекс «аллиназа-лектин», выделяемый из луковиц чеснока Allium sativum L, однако никаких данных о его биологических свойствах не приведено [Smeets К., Van Damme E.J., Van Leuven F., Peumans W.J. Glycoconj J., 1997, 14(3), 331-343]).

Исследование активности белковой фракции, выделенной из водно-солевого экстракта луковиц чеснока Allium sativum L, в отношении грибка В. sorokiniana, поражающего пшеницу и ячмень, показало, что комплекс «аллиназа-лектин» не оказывает прямого действия на фитопатоген, но подавляет рост грибка при культивировании его in vitro на листьях этих злаковых (фиг. 1 и 2). Полученный результат указывает на способность заявляемого средства активировать защитные функции пшеницы и ячменя, пораженных грибком В. sorokiniana.

Заявляемое средство защиты листьев пшеницы и ячменя от гельминтоспориоза, содержащее выделенный из чеснока посевного Allium sativum L. комплекс «аллиназа-лектин» с общей концентрацией белка 100 мкг/мл, эффективно в отношении В. sorokiniana на листьях пшеницы и ячменя в диапазоне концентраций общего белка 10^-15-10^-9 мг/мл, при оптимальном значении 10^-11 мг/мл.

Заявляемое средство не проявляет фитотоксичности во всем диапазоне биологически активных концентраций, а также безвредно для человека и теплокровных животных, поскольку его составляющие выделены из природного источника - чеснока Allium sativum L, который не только употребляется человеком в пищу, но и широко используется для лечения и профилактики различных заболеваний. В частности, экстракты чеснока применяются в фитотерапии для восстановления нормальных обменных функций организма [RU патент РФ №2171112], активно добавляются в различные продукты питания [RU патент РФ №2460309], а также могут быть использованы в качестве усилителя активности лекарственных средств [RU патент РФ №2155062].

Высокая биологическая эффективность изучаемого комплекса «аллиназа-лектин» обнаружена нами впервые.

Заявляемое средство не обладает токсичностью, проявляет высокую эффективность в сверхмалых концентрациях белка 10^-11 мг/мл и проявляет антипатогенное действие без добавления других препаратов.

Заявляемое средство защиты пшеницы и ячменя от гельминтоспориоза имеет следующие преимущества перед известными фунгицидами химического и биологического происхождения:

- широкий диапазон концентраций, в которых проявляется противогрибковая активность (10^-15-10^-9 мг белка/мл);

- низкий расход заявляемого средства при его применении, что определяется его высокой активностью при низких концентрациях;

- получение средства защиты из доступного растительного сырья;

- отсутствие фитотоксичности;

- безвредность для человека и животных в диапазоне биологически активных концентраций;

- экологически безопасная технология защиты растений.

Техническим результатом изобретения является новое эффективное и экологически безопасное средство защиты пшеницы и ячменя от гельминтоспориоза, вызываемого В. sorokiniana, получаемое из доступного растительного сырья, которое расширяет ассортимент фунгицидов природного происхождения.

Изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами его осуществления, в которых представлено получение заявляемого средства (пример 1), определение его прямого действия на фитопатогенный гриб В. sorokiniana, (пример 2), и активность средства при культивировании этого патогена на листьях пшеницы и ячменя (примеры 3-7), а также экспериментом по установлению фитотоксичности (пример 8).

Пример 1

Очищенные луковицы чеснока посевного Allium sativum L. в количестве 3 кг нарезают на фрагменты 1×1 см, заливают 10 л водно-солевого раствора состава (М): NH₄NO₃-2,06×10-², KNO₃-1,88×10^-2, CaCl₂-3,0×10^-3, MgS0₄-1,5×10^-3, KН₂РО₄-1,25×10^-3 и выдерживают в холодильнике при 4-5°С в течение 4-5 ч. К полученному таким образом экстракту после центрифугирования при 3000 g в течение 30 мин при постоянном перемешивании добавляют сухой сернокислый аммоний до получения насыщенного раствора (780 г/л) для осаждения белков и затем смесь инкубируют в течение 20 дней при 4°С. После 30-минутного центрифугирования при 10000 g для удаления солей осадок диализу ют при 4°С против 0,05 М фосфатного буфера (при соотношении объемов диализируемой фракции и диализирующей жидкости 1:50).

Обессоленный белковый осадок растворяют в минимальном объеме 0,05 М фосфатного буфера и фракционируют с помощью гель-проникающей ВЭЖХ на колонке Bio-Sil TSK-125 300×7,5 мм (Япония) с использованием хроматографа высокого давления Agilent 1200 (США). Элюцию осуществляют 0,05 М фосфатным буфером. Полученные фракции анализируют электрофоретически в 12,5%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Выделяют фракцию, которая характеризуется полосами, соответствующими молекулярным массам 6400 и 54000 Да. Проведенный триптический анализ характеристических белков в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием показывает, что белок с молекулярной массой 6400 Да гомологичен А-цепи маннозоспецифичного агглютинина (лектина) чеснока, а белок с молекулярной массой 54000 Да представляет собой фермент аллиназу. Получают фракцию, содержащую комплекс "аллиназа-лектин" с мольным соотношением аллиназа:лектин, равным 1:150, и общей концентрацией белка 100 мкг/мл, объемом 50 мл.

Полученный комплекс «аллиназа-лектин» путем десятикратного последовательного разведения водой доводят до требуемой концентрации белка.

Пример 2

Действие комплекса «аллиназа-лектин» на фитопатогенный гриб В. sorokiniana изучают методом диффузии в агар с применением лунок в толще агара [Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высшая школа, 1986]. Приготовленный картофельно-глюкозный агар (КГА) разливают в стерильные чашки Петри. В ламинар-боксе готовят споровую суспензию патогена, для этого в чашку с патогеном наливают 10-15 мл стерильного физиологического раствора и микробиологической петлей сбивают споры с воздушного мицелия, затем фильтруют полученную суспензию через асептический ватный фильтр. Концентрацию спор в суспензии доводят путем разведения до 1×10³ спор/мл, после чего раскапывают по 100 мкл полученной споровой суспензии в каждую чашку Петри и стеклянным шпателем осторожно растирают по всей поверхности КГА. После посева фитопатогенных культур в толще агаровой пластинки делают три лунки диаметром 8 мм, используя пробочное сверло соответствующего диаметра. Блоки, надрезанные пробочным сверлом на всю глубину агаровой пластинки, удаляют с помощью стерильного скальпеля. В две лунки микробиологической пипеткой вносят по 100 мкл раствора комплекса, а в третью лунку - 100 мкл физиологического раствора (контроль). Опытные чашки Петри помещают в термостат при температуре 26°С. На третьи сутки измеряют диаметр зоны ингибирования фитопатогенного гриба вокруг лунок с комплексом. Опыт проводят дважды в 3-кратной повторности.

Пример 3

Эксперименты по определению активности комплекса «аллиназа-лектин» в отношении фитопатогенного гриба В. sorokiniana на листьях пшеницы и ячменя in vitro проводят по модифицированной методике [Пыжикова Г.В., Санина А.А., Супрун Л.М., Курахтанова Т.И. Методы оценки устойчивости селекционного материала и сортов пшеницы ксепториозу. М., 1989.] на изолированных листьях, помещенных на 1%-ный агар с бензимидазолом (8-10 штук в каждую чашку Петри, 3 чашки на каждый вариант обработки). На верхние части листьев наносят по 10 мкл суспензии спор гриба В. sorokiniana (10⁵ спор/мл) в растворе комплекса «аллиназа-лектин» (10^-11 мг белка/мл). На нижние части листьев наносят по 10 мкл водной суспензии спор той же концентрации (контроль). Степень развития гельминтоспориоза определяют через 7 суток после заражения. Критерием оценки активности комплекса является количество появившихся по прошествии 7 суток типичных пятен на листьях пшеницы и ячменя. Для оценки достоверности полученных результатов используют критерий Стьюдента (компьютерная программа STATISTICA 6.0, StatSoft Inc.). Биологическая эффективность применения комплекса составляет 85%. Результаты изучения защитного действия комплекса в отношении возбудителя гельминтоспориоза В. sorokiniana на изолированных листьях пшеницы и ячменя свидетельствуют о его способности повышать устойчивость растений в отношении этого фитопатогена (фиг. 1 и 2).

Пример 4

Обработка изолированных листьев пшеницы и ячменя, проведенная по методике, описанной в примере 3, заявляемым средством при концентрации белка 10^-9 мг/мл также свидетельствует о его способности повышать устойчивость растений в отношении патогена В. sorokiniana. Биологическая эффективность применения средства составила 73%.

Пример 5

Обработка изолированных листьев пшеницы и ячменя, проведенная по методике, описанной в примере 3, заявляемым средством при концентрации белка 10^-15 мг/мл также свидетельствует о его способности повышать устойчивость растений в отношении патогена в. sorokiniana. Биологическая эффективность применения средства составила 80%.

Пример 6

Обработка изолированных листьев пшеницы и ячменя, проведенная по методике, описанной в примере 3, заявляемым средством при концентрации белка 10^-8 мг/мл свидетельствует о его неспособности повышать устойчивость растений в отношении патогена В. sorokiniana.

Пример 7

Обработка изолированных листьев пшеницы и ячменя, проведенная по методике, описанной в примере 3, заявляемым средством при концентрации белка 10^-18 мг/мл свидетельствует о его неспособности повышать устойчивость растений в отношении патогена В. sorokiniana.

Пример 8

Обработка не зараженных патогеном В. sorokiniana листьев пшеницы и ячменя по методике, описанной в примере 3, заявляемым комплексом «аллиназа-лектин» при концентрации белка 10^-11 мг/мл не приводит к какому-либо поражению тканей листьев пшеницы и ячменя, что позволяет говорить об отсутствии фитотоксичности у заявляемого средства, т.е. его безопасности для растений.