Способ экспериментального моделирования пародонтита

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для изучения этиологии и патогенеза пародонтита, а также для определения эффективности новых методов лечения пародонтита.

Поиск оптимальной экспериментальной модели пародонтита на животных необходим для изучения возможности использования новых методов и лекарственных форм при лечении заболеваний пародонта. Использование патоморфологических исследований для оценки эффективности новых методов лечения позволяет объективно оценить ожидаемый результат фармакотерапии, что, как правило, невозможно на человеке.

Хронический генерализованный пародонтит (ХГП) развивается под влиянием местных и общих факторов, ведущим из которых считается бактериальный. В настоящее время роль пародонтопатогенов, таких KaicAggregatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia и Porphyromonas gingivalis в развитии воспалительных заболеваний пародонта тесно связывают с ответной иммуновоспалительной реакцией на бактериальную инвазию, представляющую собой каскад клеточных реакций и механизмов, приводящих к резорбции альвеолярной кости, и также зависящей от общесоматических и генетических факторов. Воздействие пародонтопатогенов на ткани пародонтального комплекса запускает ряд иммунных механизмов. Также установлена важная роль про- и противовоспалительных цитокинов в регуляции воспаления в пародонте.

Прогрессирующую деструкцию костной ткани у больных с заболеваниями пародонта связывают именно с комбинацией цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНОα и простагландинами E2. Данные цитокины способны активизировать остеокластогенез и резорбцию кости остеокластами. Усиленная миграция макрофагов под воздействием цитокинов и их постоянное присутствие в тканях усугубляет деструктивные процессы в пародонте.

Известен способ моделирования пародонтита (авт.св. СССР 1700574, «Способ моделирования пародонтита» Г.В. Мошкин, Е.К. Ткаченко, Р.Д. Бараш (ОНИИС); опубл. 23.12.91), согласно которому экспериментальным животным - крысам вводят хлористый аммоний в дозе 3,5-4,5 мг на 1 г массы тела один раз в сутки в течение не менее 30 дней. Недостатком известного способа является то, что пародонтит моделируется метаболическим ацидозом, исключая влияние на иммунную систему животных, что дает недостаточно полную картину моделируемой патологии. Кроме того, процесс моделирования достаточно длителен и трудоемок, поскольку требует ежедневных введений в пищу строго дозированного количества хлористого аммония.

Известен способ получения экспериментальной модели пародонтита, когда животных иммунизируют четырехкратным подкожным введением гомологической ткани участков пародонта в смеси со стимулятором Фрейнда (авт. св. СССР 173894, A.M. Каминский (ОНИИС); 06.08.65). В качестве антигена берут участки пародонта крыс того же возраста - зубы, десна и участок челюсти. Иммунизацию повторяют четыре раза с интервалом в неделю. Срок наблюдения составляет 3-4 месяца. Данный способ достаточно длителен и трудоемок и полностью не отражает патогенетический механизм этого заболевания у человека.

Известен способ получения модели пародонтита, включающий помещение половозрелых крыс в общую клетку площадью 0,018 м² на особь (пат. РФ 2252009, Р.З. Буранбаев, Р.А. Мирсояпов, Ю.Ш. Зарипова, Ф.А. Коюмов, А.Ф. Коюмова; 27.01.2003, 27.07.2004, 20.05.2005). При этом перед помещением в клетку, под эфирным наркозом, используя стоматологический цемент, создают искусственную зубную бляшку вокруг шейки верхних и нижних резцов с шероховатой поверхностью, заходящую под десну на 0,1-0,5 мм, при этом в процессе моделирования животные получают кашицеобразную пищу. На 30-е сутки наблюдали отечность и цианоз десны, в области резцов наблюдали появление карманов глубиной 1-2 мм, появление подвижности резцов 1-2 степени. Однако, учитывая анатомию зубо-челюстной системы у крыс, данная модель теряет актуальность, т.к. постоянно растущие резцы грызунов имеют физиологическую подвижность и действие хронической травмы ослабевает.

В настоящее время наиболее популярны лигатурные методы воспроизведения пародонтита в различных интерпритациях. Известен способ моделирования пародонтита, когда использован «лигатурный метод», сущность которого заключается во вшивании шелковой лигатуры в десну в области нижних резцов. Через 14 дней лигатуру удаляли и еще через 15 и 30 дней после наложения лигатуры изучали состояние пародонта методом прижизненной микроскопии сосудов микроциркуляторного русла. После забоя животных (15 и 30 дней после снятия лигатуры) проводили патоморфологическое исследование челюстей [Боричевская Л.В. Течение пародонтита при экспериментальном судорожном синдроме, обоснование методов коррекции, Автореферат, 2002. – М. - 25 с.].

Известен способ моделирования пародонтита, когда крысам под тиопенталовым наркозом (20 мг/кг) моделировали лигатур-индуцированный пародонтит путем наложения хлопковой лигатуры на центральный резец верхней челюсти, фиксируя кончики нити фотополимерным пломбировочным материалом. Сущность данной модели состоит в создании ретенционного пункта для микробной биопленки, которая инициирует развитие воспаления и деструкции тканей пародонта [Трояненко Л.М., Чумакова Ю.Г. Сравнительная оценка лечебно-профилактического действия зубных паст на модели пародонтита у крыс // Вестник стоматологии. - 2014. - №3. - С. 9-13]. Недостатком данных способов моделирования является постоянный рост резцов, что приводит к смещению лигатуры от края десны, снижая действие травмирующего фактора и затрудняя образование зубного налета. В результате такой важный этиологический фактор в развитии воспалительных заболеваний пародонта у человека как зубная бляшка исключается в экспериментальной модели.

Известен способ моделирования пародонтита, в котором для моделирования иммунодефицитного состояния (ИДС) крысам подкожно в бедро вводили циклофосфан по 50 мг/кг. Сначала по инъекции двое суток подряд, затем для поддержания ИДС циклофосфан вводили в той же дозе (50 мг/кг, однократно) с периодичностью 10 суток. На 10-й день после первой инъекции циклофосфана, когда у животных развилось ИДС, воспроизводили пародонтит путем прошивания десны тонкой шелковой лигатурой вокруг резцов нижней челюсти на 14 суток [Дубровин Д.С. Применение полиоксидония для коррекции течения пародонтита на фоне иммунодефицитного состояния (экспериментальное исследование), Автореферат, 2004. - М. - 23 с.]. Этот способ выбран за прототип. Недостатком использованной модели является, во-первых, фиксация лигатуры на резцах нижней челюсти, а во-вторых, циклофосфан, являясь цитостатиком обладает анкилирующим действием с преимущественным угнетением активности B-субпопуляций лимфоцитов, основной механизм иммунодепрессивного действия которых заключается в блокировании митоза опухолевых клеток, что патогенетически не соответствует механизму развития пародонтита у человека.

Задачей изобретения является повышение эффективности моделирования явлений пародонтита.

Технический результат заключается в обеспечении стабильности действия травмирующего фактора и облегчения процесса образования зубного налета за счет предотвращения смещения лигатуры путем наложения ее на второй моляр верхней челюсти; ускорение развития воспаления за счет иммунодепрессивного действия преднизолона на T-клеточный иммунитет.

Это достигается за счет того, что половозрелым крысам породы «Wistar» в/м вводят преднизолон из расчета 12 мг/кг веса животного на 1-е, 3-и и 5-е сутки, при этом на 5-е сутки на второй моляр верхней челюсти под в/м наркозом накладывают лигатуру.

Признаками пародонтита являются: воспаление мягких тканей, окружающих зуб (кровоточивость десны, гиперемия, отечность); образование пародонтального кармана с замещением грануляционной тканью резорбированной костной ткани, а также патологическая подвижность зубов. Для снижения реактивности организма использовался глюкокортикоидный препарат преднизолон.

Преднизолон, являясь глюкокортикоидом, обладает иммунодеспрессивным действием, активно подавляя фагоцитоз (T-клеточный иммунитет), что ведет к снижению активности макрофагов и лимфоцитов, способствуя тем самым развитию бактериальной инфекции и усугублению воспалительного процесса. Кроме того, он угнетает образование костной ткани и усиливает ее резорбцию, снижая концентрацию кальция в сыворотке крови, что приводит к вторичной гиперфункции паращитовидных желез и одновременной стимуляции остеокластов и ингибированию остеобластов. Преднизолон уже применяется в экспериментальных моделях на животных для воспроизведения остеопороза [Bitto A1, Polito F, Burnett B, Levy R, Di Stefano V, Armbruster MA, Marini H, Minutoli L, Altavilla D, Squadrito F «Protective effect of genistein aglycone on the development of osteonecrosis of the femoral head and secondary osteoporosis induced by methylprednisolone in rats.», J Endocrinol. 2009 Jun; 201(3): 321-8]. Для моделирования остеопороза использовалась высокая дозировка преднизолона с целью подавления костной формации, однако для воспроизведения модели воспалительного процесса в тканях пародонта основаполагающим фактором является иммунодепрессивное действие препарата.

В ходе эксперимента была подобрана оптимальная дозировка - 12 мг/кг веса животного, на фоне введения которой отмечалось угнетение клеточного иммунитета, клинически проявляющаяся в виде активного развития воспалительного процесса (кровоточивость десны, гиперемия, отечность), при этом не оказывалось влияния на костную формацию. Половозрелые крысы породы Wistar были разделены на пять групп. В первой (контрольной) группе животные содержались в стандартных условиях с привычным рационом питания. Животным второй группы на второй моляр верхней челюсти на 5-е сутки от начала эксперимента фиксировали лигатуру на фоне приема мягкой пищи. Третьей группе животных на 1-е, 3-и и 5-е сутки вводили преднизолон в/м в бедро в дозе 4,8 мг на животное, без фиксации лигатуры на зубах. Животные соблюдали обычный рацион питания. В четвертой группе крысам однократно вводили преднизолон в/м в бедро в дозе 4,8 мг на животное и в день введения препарата фиксировали лигатуру на втором моляре верхней челюсти. Крысы также питались мягким кормом. Животным пятой группы на 1-е, 3-и и 5-е сутки вводили преднизолон в/м в бедро в дозе 4,8 мг на животное. На 5-е сутки после введения третьей дозы крысам фиксировали лигатуру, диета - мягкий корм. Получена следующая клиническая и морфологическая картина пародонтита, схожая с таковой у человека (табл. 1, 2, 3).

На 5-е сутки проводилось наложение лигатуры, поскольку полученные данные гистологического исследования свидетельствуют о изменениях в тканях пародонта, позволяющие получить требуемый результат.

На 19-е сутки от начала эксперимента клинически отмечалось проявление воспаления в виде кровоточивости десны, при зондировании в области наложения лигатуры определялся пародонтальный карман глубиной до 1,5 мм (в норме глубина десневой борозды 0,3 мм у крысы) (Рис. 1 - вид здоровой слизистой оболочки полости рта крысы), подвижность зубов (Рис. 2 - область ярко выраженного гнойного воспалительного процесса в области моляров верхней челюсти слева у крысы на фоне трехкратного введения преднизолона с фиксацией лигатуры и питанием мягким кормом. 14-е сутки), а также гистологически - значительное увеличение числа остеокластов в зоне поражения с признаками разрушения периодонтальной связки, резорбции как альвеолярной кости, так и цемента корня зуба по сравнению с нормальным строением тканей пародонта (Рис. 3 - нормальное строение тканей пародонта. Периодонтальная связка, соединяющая поверхности прилежащей альвеолярной кости и зуба. Контрольная группа животных. Окраска гематоксилином и эозином. X 400, где 1 - альвеолярная кость, 2 - периодонтальная связка, 3 - цемент зуба, 4 - пульпа зуба; рис. 4 - разрушение альвеолярной кости, отделяющей зуб от мягких тканей десны, вокруг зуба располагаются пучки фиброзной ткани, пульпа зуба подвержена некрозу. Окраска гематоксилином и эозином. X 200, где 1 - альвеолярная кость, 2 - пучки фиброзной ткани (пародонтальный карман), 3 - цемент зуба, 4 - пульпа зуба).

Способ осуществляется следующим образом:

Половозрелым крысам породы «Wistar» в/м вводят преднизолон в дозировке 12 мг/кг веса животного на 1-е, 3-и и 5-е сутки, при этом на 5-е сутки под в/м наркозом (например, 0,3 мл «Zoletil 50») на второй моляр верхней челюсти накладывают лигатуру на 14 суток. В процессе моделирования пародонтита животных кормят мягкой пищей.

Пример

16 половозрелым крысам породы «Wistar» (самцам) весом 396±0,2 в/м вводили преднизолон из расчета 12 мг/кг веса животного, т.е. 4,8 мг, на 1-е, 3-и и 5-е сутки, при этом на 5-е сутки под в/м наркозом - 0,3 мл «Zoletil 50» на второй моляр верхней челюсти наложили лигатуру на 14 суток. В процессе моделирования пародонтита животных кормили мягкой пищей (размачивали в воде гранулированный корм для лабораторных животных). На 19-е сутки отмечены признаки пародонтита в виде воспаления мягких тканей, окружающих зуб; образовавшихся пародонтальных карманов, глубиной до 1,5 мм с замещением грануляционной тканью резорбированной костной ткани, а также патологическая подвижность зубов 2-й степени.