СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА В ТКАНЯХ СЕРДЦА

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для определения активности ангиотензин-превращающего фермента в биоптатах тканей сердца как потенциального маркера проаритмогенной активности.

Фибрилляция предсердий (синоним - мерцательная аритмия) - разновидность наджелудочковой тахиаритмии с хаотической электрической активностью предсердий с частотой импульсов 350-700 в минуту, что исключает возможность их координированного сокращения. Фибрилляция предсердий - наиболее часто встречающийся вид нарушений сердечного ритма, являющийся фактором риска развития тромбоэмболических осложнений и летальных исходов. Этим заболеванием страдают 1-2% общей популяции, этот показатель растет, и, по прогнозам экспертов, этот показатель в развитых странах будет увеличиваться в связи со старением населения. Приблизительно 1% больных относятся к возрастной группе старше 60 лет; тогда как уже 12% находятся в возрасте от 75 до 84 лет. Более трети больных с фибрилляцией предсердий относятся к возрастной группе 80 лет и старше [1-4].

Фибрилляция предсердий ассоциируется с 2-кратным увеличением смертности у женщин и 1,5-кратным у мужчин, 5-кратным увеличением риска инсульта, 3-6 кратным повышением риска сердечной недостаточности, 2-кратным риском развития деменции [2, 5]. Исследования показали, что у 20-30% больных с ишемическим инсультом диагностирована фибрилляция предсердий [3]. Поражение белого вещества головного мозга, нарушение когнитивных функций, снижение качества жизни, депрессивные состояния - сопутствующие проявления данного заболевания. Ежегодно от 10 до 40% пациентов с фибрилляцией предсердий госпитализируются в медицинские стационары [4].

Помимо того, что фибрилляция предсердий является причиной серьезных осложнений и инвалидизации пациентов, данное заболевание влечет за собой колоссальные экономические потери. Так, например, затраты, связанные с фибрилляцией предсердий, составляют около 1% от общего объема расходов на здравоохранение в Великобритании. Известно, что в США расходуется от 6 до 26 млн. долларов в год на лечение фибрилляции предсердий и ее многочисленных осложнений [2-5]. Не вызывает сомнения тот факт, что при отсутствии своевременной диагностики и эффективного лечения расходы, связанные с данным заболеванием, будут неуклонно расти.

В настоящее время не существует биохимических маркеров, позволяющих предсказать риск развития фибрилляции предсердий. Известно, однако, что в патогенезе фибрилляции предсердий важную роль играют компоненты ренин-ангиотензиновой системы [6, 7]. Показано, что у пациентов с фибрилляцией предсердий уровень экспрессии ангиотензин-превращающего фермента, продуцирующего ангиотензин II, в тканях сердца значительно (в 3 раза) повышен по сравнению с уровнем экспрессии фермента в сердце других пациентов [8]. Повышен у таких пациентов и уровень рецепторов к ангиотензину II [9]. У трансгенных мышей, у которых уровень экспрессии ангиотензин-превращающего фермента в сердце был значительно превышен по сравнению с нормой, наблюдались увеличенный размер предсердий, развитие фибрилляции предсердий и высокая частота случаев внезапной смерти [10]. Повышение экспрессии ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца приводит к уменьшению экспрессии коннексинов и к значительному снижению электропроводимости предсердий и желудочков, что может быть причиной развития аритмии [11]. Увеличение содержания ангиотензина II при повышении экспрессии ангиотензин-превращающего фермента способствует повышению содержания кальциевых каналов и уменьшению натриевых, что также увеличивает риск аритмии [7].

Таким образом, несомненна прямая связь повышенной экспрессии ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца и увеличения риска развития фибрилляции предсердий, то есть повышение уровня ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца является потенциальным маркером риска развития аритмии.

Уровень экспрессии фермента можно оценить методом иммуноферментного анализа с помощью моноклональных антител, направленных к ангиотензин-превращающему ферменту человека [12]. Метод является высокочувствительным, но дорогостоящим, сложным и требующим высокой профессиональной подготовки. Гораздо более распространенными являются методы, позволяющие оценивать уровень экспрессии ангиотензин-превращающего фермента косвенно, по его ферментативной активности.

Среди наиболее широко используемых в настоящее время на практике методов определения активности ангиотензин-превращающего фермента необходимо отметить следующие: 1) Спектрофотометрический метод, основанный на изменении оптической плотности среды при ферментативном гидролизе субстратов, содержащих хромофорную группу [13]. Метод несложный, но не позволяющий определять активность фермента в гомогенатах тканей при низком содержании фермента. 2) Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии [14] позволяет определять активность фермента в различных средах, в том числе в гомогенатах тканей, с использованием субстратов разнообразной структуры. Недостатком метода является сложность в проведении анализа, дороговизна и непригодность для массовых определений активности фермента. 3) Флуоресцентный метод, основанный на детекции продуктов гидролиза субстратов под действием ангиотензин-превращающего фермента с помощью их модификации с образованием флуорогена. Метод относительно дешев и пригоден для широкомасштабных измерений, поскольку может быть использован не только флуориметр, но и микропланшетный ридер.

В качестве прототипа предлагаемого способа нами выбран известный способ определения активности ангиотензин-превращающего фермента по скорости гидролиза синтетических трипептидных субстратов, содержащих дипептид His-Leu на С-конце. В результате ферментативного гидролиза происходит отщепление этого пептида, который затем модифицируют орто-фталевым альдегидом с образованием флуорогена и определяют его количество по флуоресценции при λ_возб 370 нм, λ_эмис 500 нм, сравнивая сигнал флуоресценции с сигналом контрольного His-Leu [15].

Недостатком прототипа является то, что он обладает ограничениями применительно к тканям, в которых содержание ангиотензин-превращающего фермента невелико. Для достижения значимых сигналов флуоресценции за рациональное время (по крайней мере, в течение рабочего дня) необходимо использовать относительно концентрированные гомогенаты таких тканей, присутствие в которых эндогенных ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента, а также аминопептидазы, расщепляющей His-Leu, может значительно искажать определяемые значения активности фермента, а именно приводить к существенному занижению результатов.

Известно, что в сердце содержание ангиотензин-превращающего фермента мало [16, 17], поэтому возникает необходимость создания метода корректного определения активности ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца как потенциального маркера риска развития фибрилляции предсердий.

Технический результат, достигаемый при осуществлении заявляемого способа, заключается в повышении точности определения активности ангиотензин-превращающего фермента в гомогенатах тканей, в которых его содержание невелико, в частности в биоптатах тканей сердца.

Заявляемый способ позволяет учесть присутствие эндогенных ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента и аминопептидазы в биоптатах тканей и определить в них истинную активность ангиотензин-превращающего фермента.

Технический результат достигается за счет того, что активность ангиотензин-превращающего фермента определяется при необходимом для диссоциации комплексов «эндогенный ингибитор - ангиотензин-превращающий фермент» разбавлении гомогенатов тканей сердца и при подавлении активности сопутствующей аминопептидазы.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для определения активности ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца получают гомогенат биоптата ткани сердца из исходного весового отношения ткани к буферу, равного 1:9. Супернатант, полученный путем центрифугирования гомогената, разбавляют в 10-30 раз. Затем один объем разбавленного супернатанта добавляют к пяти объемам смеси, состоящей из 0,2-2,5 мМ пептидного субстрата, содержащего дипептид His-Leu на С-конце, и 5-50 мкМ ингибитора аминопептидазы, растворенных в буфере с pH 7,5-8,3, содержащем 0,3 М NaCl, 1 мкМ ZnCl₂. Проводят реакцию в течение 1-4 часов при 25-37°С. После чего определяют в реакционной среде содержание образованного дипептида His-Leu. При этом активность ангиотензин-превращающего фермента определяют по количеству микромолей His-Leu, образованному в единицу времени.

На фиг. 1 представлены зависимости наблюдаемой активности ангиотензин-превращающего фермента, выраженные в мЕд/мл (А) и в % (Б) от максимального значения, при гидролизе субстрата Cbz-L-Phe-L-His-L-Leu от разбавления супернатантов гомогенатов тканей сердца. Активность фермента определялась по скорости накопления продукта реакции His-Leu.

Обозначения: левое предсердие - черные ромбики, правое предсердие - прозрачные ромбики, левый желудочек - черные круги, правый желудочек - прозрачные круги.

На фиг. 2 представлены зависимости наблюдаемой активности ангиотензин-превращающего фермента, выраженные в мЕд/мл (А) и в % (Б) от максимального значения, при гидролизе субстрата Cbz-L-Phe-L-His-L-Leu в присутствии ингибитора аминопептидазы бестатина от разбавления супернатантов гомогенатов тканей сердца. Активность фермента определялась по скорости накопления продукта реакции His-Leu.

Обозначения: левое предсердие - черные ромбики, правое предсердие - прозрачные ромбики, левый желудочек - черные круги, правый желудочек - прозрачные круги.

Способ осуществляют следующим образом.

Из биоптатов тканей сердца получают гомогенаты при весовом соотношении ткань : буфер = 1:9 (г/г). После проведения экстракции фермента в буферный раствор гомогенаты центрифугируют для отделения нерастворимой фракции. Полученную жидкую фракцию гомогената разбавляют в 10-30 раз для диссоциации комплексов фермент-ингибитор и проводят гидролиз субстрата под действием ангиотензин-превращающего фермента в присутствии 5-50 мкМ ингибитора аминопептидазы. Для этого выбранный объем супернатанта добавляют к 5 объемам смеси, состоящей из 0,2-2,5 мМ пептидного субстрата, содержащего дипептид His-Leu на С-конце, например Cbz-Phe-His-Leu или Hip-His-Leu, и 5-50 мкМ ингибитора аминопептидазы, например бестатина, растворенных в буфере с pH 7,5-8,3, содержащем 0,3 М NaCl, 1 мкМ ZnCl₂, и проводят реакцию в течение 1-4 часов при 25-37°С.

Останавливают реакцию путем добавления 2,5 объемов 1 н. NaOH и модифицируют продукт ферментативной реакции His-Leu путем внесения 0,5 объема 0,15 М орто-фталевого альдегида в метаноле. После инкубации в течение 10-20 мин и внесения одного объема 5 н. НС1 измеряют развившуюся флуоресценцию на флуориметре или микропланшетном ридере при длине волны возбуждения 379 нм и длине волны эмиссии 500 нм.

Фоновую флуоресценцию определяют аналогично, но супернатант вносят в реакционную смесь уже после добавления раствора щелочи.

Определяют флуоресценцию стандартных растворов продукта ферментативного гидролиза - His-Leu. Для этого к пяти объемам раствора His-Leu концентрацией от 0,005 до 0,25 мМ в том же буфере, в котором проводился гидролиз субстрата, добавляют по одному объему того же буфера для достижения общего объема раствора, равного объему реакционной смеси субстрата с супернатантом, а затем добавляют растворы щелочи, орто-фталевого альдегида и кислоты, как описано выше. Определяют флуоресценцию конечных растворов при указанных длинах волн. Строят калибровочную прямую по зависимости полученной флуоресценции от концентрации His-Leu.

Концентрацию продукта реакции His-Leu в реакционной смеси определяют по флуоресценции, полученной в результате проведения ферментативной реакции и последующей модификации продукта реакции орто-фталевым альдегидом, из величины которой вычитают фоновую флуоресценцию, а затем полученное значение соотносят с соответствующим значением флуоресценции на калибровочной прямой. Единица активности фермента представляет собой то количество препарата, которое образует 1 мкмоль His-Leu за 1 мин в указанных условиях.

Приводим конкретные примеры осуществления предлагаемого способа.

Пример 1. Ткани желудочков пациентов №1 и №3.

По 0,1 г ткани левого и правого желудочков из сердца разных пациентов измельчали в гомогенизаторе типа Поттер и проводили экстракцию белков, в том числе ангиотензин-превращающего фермента, 0,05 М фосфатным буфером, pH 7,5, содержащим 0,15 М NaCl, 1 мкМ ZnCl₂ и 0,25% Тритон Х-100, при соотношении ткань : буфер = 1:9 (г/г). После инкубации гомогенатов в течение 16 часов при 4°С отделяли нерастворимый осадок центрифугированием, а супернатант использовали для определения активности ангиотензин-превращающего фермента по способу-прототипу, но при разных предварительных разведениях супернатанта. Для этого к 100 мкл 2,4 мМ раствора субстрата Cbz-Phe-His-Leu в 0,1 М фосфатном буфере, pH 8,3, содержащем 0,3 М NaCl и 1 мкМ ZnCl₂, добавляли 20 мкл полученного супернатанта, предварительно разбавленного тем же буфером от 1 до 30 раз, и проводили реакцию в течение 1 часа. Образованный продукт реакции His-Leu модифицировали орто-фталевым альдегидом и измеряли флуоресценцию при длине волны возбуждения 370 нм и длине волны эмиссии 500 нм. Аналогично измеряли фоновую флуоресценцию для всех разведений супернатанта, но супернатант вносили в реакционную смесь после внесения раствора щелочи. Независимо строили калибровочный график флуоресценции при концентрациях His-Leu от 5 мкМ до 100 мкМ.

Определяли величины активности ангиотензин-превращающего фермента по соотнесению полученной в результате проведения ферментативной реакции флуоресценции, из которой была вычтена фоновая флуоресценция для соответствующего разведения супернатанта, с флуоресценцией на калибровочной прямой, и определению, таким образом, концентрации His-Leu, при которой такая флуоресценция наблюдалась. Определенная концентрация His-Leu соответствует той концентрации субстрата, которая подверглась гидролизу под действием фермента за время проведения реакции. За единицу активности ангиотензин-превращающего фермента принимали то его количество, которое гидролизует 1 мкмоль субстрата за 1 мин.

На фиг. 1 представлены зависимости величин определяемой активности ангиотензин-превращающего фермента от исходного разбавления супернатантов, полученных из гомогенатов желудочков, в пересчете на неразбавленные. Определяемые величины активности фермента в гомогенатах желудочков разных пациентов, выраженные как в единицах активности, так и в процентах от максимальной величины, зависели от разбавления супернатантов гомогенатов тканей нелинейно, а именно приведенная активность, то есть активность, пересчитанная на неразбавленный супернатант, росла с разбавлением, что указывает на присутствие в желудочках эндогенных ингибиторов фермента. Таким образом, определение активности по способу-прототипу без учета разбавления супернатантов, полученных при центрифугировании гомогенатов желудочков, может приводить к существенным ошибкам в определении активности фермента. Для того чтобы можно было пренебречь интерферирующим действием ингибиторов, супернатанты гомогенатов желудочков необходимо разбавить в 10-30 раз.

Пример 2. Ткани предсердий пациентов №2 и №5.

По 0,1 г ткани левого и правого предсердий разных пациентов измельчали в гомогенизаторе типа Поттер и проводили экстракцию белков, в том числе ангиотензин-превращающего фермента, как описано в примере №1, при соотношении ткань : буфер = 1:9 (г/г). После инкубации гомогената в течение 16 часов при 4°С отделяли нерастворимый осадок центрифугированием, а супернатант использовали для определения активности ангиотензин-превращающего фермента, как описано в примере 1.

На фиг. 1 представлены зависимости величин определяемой активности ангиотензин-превращающего фермента от исходного разбавления супернатантов, полученных из гомогенатов предсердий, в пересчете на неразбавленные. Определяемые величины активности фермента в гомогенатах предсердий разных пациентов, выраженные как в единицах активности, так и в процентах от максимальной величины, зависели от разбавления супернатантов гомогенатов тканей нелинейно, а именно приведенная активность росла с разбавлением, что указывает на присутствие в предсердиях эндогенных ингибиторов фермента. Таким образом, определение активности по способу-прототипу без учета разбавления супернатантов, полученных при центрифугировании гомогенатов предсердий, может приводить к существенным ошибкам в определении активности фермента. Для того чтобы можно было пренебречь интерферирующим действием ингибиторов, супернатанты гомогенатов предсердий необходимо разбавить в 10-30 раз.

Пример 3. Ткани желудочков пациентов №1 и №3.

По 0,1 г ткани левого и правого желудочков разных пациентов измельчали в гомогенизаторе типа Поттер и проводили экстракцию белков, в том числе ангиотензин-превращающего фермента, как описано в примере 1, при соотношении ткань : буфер = 1:9. После инкубации гомогенатов в течение 16 часов при 4°С отделяли нерастворимый осадок центрифугированием, а супернатант использовали для определения активности ангиотензин-превращающего фермента по предложенному способу. Для этого к 100 мкл 2,4 М раствора субстрата Cbz-Phe-His-Leu и 5 мкМ ингибитора аминопептидазы бестатина в 0,1 М фосфатном буфере, pH 8,3, содержащем 0,3 М NaCl, 1 мкМ ZnCl₂, добавляли 20 мкл полученного супернатанта, предварительно разбавленного от 1 до 30 раз, и проводили реакцию в течение 4 часов. Определяли концентрацию образованного продукта реакции His-Leu, как описано в примере 1.

На фиг. 2 представлены зависимости величин определяемой активности ангиотензин-превращающего фермента в присутствии ингибитора аминопептидазы от исходного разбавления супернатантов, полученных из гомогенатов желудочков, в пересчете на неразбавленные. Определяемые таким образом активности ангиотензин-превращающего фермента, выраженные как в единицах активности, так и в процентах от максимальной величины, зависели от разбавления супернатантов, но слабее, чем в отсутствие ингибитора аминопептидазы. Более того, полученные по предложенному способу величины активности ангиотензин-превращающего фермента при максимальных разбавлениях супернатантов гомогенатов желудочков превышали аналогичные значения, полученные в отсутствие ингибитора аминопептидазы, как описано в примере 1 и представлено на фиг. 1.

Таким образом, внесение в реакционную среду субстрата с ферментом ингибитора аминопептидазы приводит к увеличению наблюдаемой активности ангиотензин-превращающего фермента при небольших предварительных разведениях супернатантов гомогенатов желудочков до 10 раз, что связано с блокированием активности аминопептидазы и сохранением тем самым накапливающегося His-Leu в реакционной среде. В целом, необходимое предварительное разведение супернатантов гомогенатов желудочков вкупе с проведением ферментативной реакции в присутствии ингибитора аминопептидазы позволяет минимизировать возможные ошибки в определении активности ангиотензин-превращающего фермента в тканях желудочков.

Пример 4. Ткани предсердий пациента №2 и №5.

По 0,1 г ткани левого и правого предсердий разных пациентов измельчали в гомогенизаторе типа Поттер и проводили экстракцию белков, в том числе ангиотензин-превращающего фермента, как описано в примере 1, при соотношении ткань : буфер = 1 : 9. После инкубации гомогената в течение 16 часов при 4°С отделяли нерастворимый осадок центрифугированием, а супернатант использовали для определения активности ангиотензин-превращающего фермента по предложенному способу. Для этого к 100 мкл 2,4 М раствора субстрата Cbz-Phe-His-Leu и 50 мкМ ингибитора аминопептидазы бестатина в 0,1 М фосфатном буфере, pH 8,3, содержащем 0,3 М NaCl, 1 мкМ ZnCl₂, добавляли 20 мкл полученного супернатанта, предварительно разбавленного от 1 до 30 раз, и проводили реакцию в течение 4 часов. Определяли концентрацию образованного продукта реакции His-Leu, как описано в примере 1.

На фиг. 2 представлены зависимости величин определяемой активности ангиотензин-превращающего фермента в присутствии ингибитора аминопептидазы от исходного разбавления супернатантов, полученных из гомогенатов предсердий, в пересчете на неразбавленные. Определяемые таким образом активности ангиотензин-превращающего фермента зависели от разбавления супернатантов, но слабее, чем в отсутствие ингибитора аминопептидазы. Более того, полученные по предложенному способу величины активности ангиотензин-превращающего фермента при максимальных разбавлениях супернатантов гомогенатов предсердий превышали аналогичные значения, полученные в отсутствие ингибитора аминопептидазы, как описано в примере 2 и представлено на фиг. 1.

Таким образом, внесение в реакционную среду субстрата с ферментом ингибитора аминопептидазы приводит к увеличению наблюдаемой активности ангиотензин-превращающего фермента при небольших предварительных разведениях супернатантов гомогенатов предсердий до 10 раз, что связано с блокированием активности аминопептидазы и сохранением тем самым накапливающегося His-Leu в реакционной среде. В целом, необходимое предварительное разведение супернатантов гомогенатов предсердий вкупе с проведением ферментативной реакции в присутствии ингибитора аминопептидазы позволяет минимизировать возможные ошибки в определении активности ангиотензин-превращающего фермента в тканях предсердий.

Всего по предложенному способу определение активности ангиотензин-превращающего фермента было выполнено на 36 образцах тканей (левого и правого желудочков, а также левого и правого предсердий) разных отделов сердца пациентов, полученных post mortem.

Верификацию предложенного способа осуществляли сопоставляя величины активности ангиотензин-превращающего фермента в супернатантах, полученных из гомогенатов тканей сердца, а также активности очищенного фермента, гомогенного по SDS-электрофорезу, с определяемым количеством активного иммунореактивного белка, преципитируемого на плашке с иммобилизованными моноклональными антителами к ангиотензин-превращающему ферменту по [12]. При определении активности ангиотензин-превращающего фермента предложенным методом соотношение величин активности и иммунореактивного белка было одинаковым для высокоочищенного фермента и фермента в супернатантах, полученных из гомогенатов разных отделов сердца. В то же время определение активности ангиотензин-превращающего фермента по способу-прототипу [15] приводило к занижению активности фермента в супернатантах, полученных из гомогенатов тканей сердца, в 1,5-3 раза.

Таким образом, предложенный способ позволяет оценить истинное содержание ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца.

Литература:

1. Go A.S., Hylek Е.М., Phillips K.А., et al. Prevalence of diagnosed atrial fibrillation in adults: national implications for rhythm management and stroke prevention: the Anticoagulation and Risk Factors in Atrial Fibrillation (ATRIA) Study. JAMA, 2001, 285, 2370-5.

2. January et al. Executive Summary: AHA/ACC/HRS Atrial Fibrillation Guideline. JACC, 201, 64, 2246-80.

3. Диагностика и лечение фибрилляции предсердий. Рекомендации РКО, ВНОА и АССХ, 2012 г.

4. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS. EHJ-August, 2016.

5. T.F.. Atrial fibrillation and stroke: risk factors, anticoagulation, and left atrial appendage occluders. Eur Heart J, 2016, 37, 2443-2445.

6. Ehrlich JR, Hohnloser SH, Nattel S. Role of angiotensin system and effects of its inhibition in atrial fibrillation: clinical and experimental evidence. Eur Heart J, 2006, 27, 512-518.

7. Iravanian S, Dudley SC. The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) and cardiac arrhythmias. Heart Rhythm, 2008, 5, S12-S17.

8. Goette A., Staack Т., С., et al. Increased expression of extracellular signal-regulated kinase and angiotensin-converting enzyme in human atria during atrial fibrillation. J. Am. Coll. Cardiol., 2000, 35, 1669-77.

9. Boldt A., Wetzel U., Weigl J., et al. Expression of angiotensin II receptors in human left and right atrial tissue in atrial fibrillation with and without underlying mitral valve disease. J. Am. Coll. Cardiol., 2003, 42, 1785-1792.

10. Xiao H.D., Fuchs S., Campbell D.J., et al. Mice with cardial-restricted angiotensin-converting enzyme (ACE) have atrial enlargement, cardiac arrithmia, and sudden death. Am. J. Pathol., 2004, 165, 1019-1032.

11. Kasi V.S., Xiao H.D., Shang L.L., et al. Cardiac-restricted angiotensin-converting enzyme overexpression causes conduction defects and connexin dysregulation. Am. J. Heart Circ. Physiol, 2007, 293, 182-192.

12. Danilov S, Savoie F, Lenoir B, et al. Development of enzyme-linked immunoassays for human angiotensin I converting enzyme suitable for large-scaled studies. J Hypertens, 1996, 14, 719-727.

13. Holmquist В, P, Riordan JF. A continuous spectrophotometric assay for angiotensin-converting enzyme. Anal Biochem, 1979, 95, 540-548.

14. Menq QC, Balcells E, Dell'Italia L, et al. Sensitive method of quantitation of angiotensin-converting enzyme (ACE) activity in tissue. Biochem Pharmacol, 1995, 50, 1445-1450.

15. Piquilloud Y., Reinharz A., Roth M. Studies on the angiotensin converting enzyme with different substrates. Biochim. Biophys. Acta-Enzymology, 1970, 206, 136-142.

16. Vago T, Bevilacqua M, Conci F, et al. (1992) Angiotensin converting enzyme binding sites in human heart and lung: comparison with rat tissues. Br J Pharmacol 197: 821-825.

17. Barreto-Chaves ML, Heimann A, Krieger JE (2000) Stimulatory effect of dexamethasone on angiotensin-converting enzyme in neonatal rat cardiac myocytes. Braz J Med Biol Res 33: 661-664.