Способ моделирования хронического травматического остеомиелита

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной хирургии и травматологии, и может быть использовано для моделирования травматического остеомиелита трубчатых костей, приближая его к клиническим условиям для изучения патогенеза, клиники и обоснования методики лечения заболевания.

В современной медицине под хроническим остеомиелитом понимают «инфекционный воспалительный процесс с вовлечением структурных элементов кости, т.е. неспецифическое гнойно-воспалительное и гнойно-некротическое поражение костной ткани, костного мозга, надкостницы и окружающих мягких тканей, имеющее затяжное рецидивирующее течение» (Амирасланов Ю.А. Современные принципы хирургического лечения хронического остеомиелита (лекция) / Ю.А. Амирасланов, A.M. Светухин, И.В. Борисов // Инфекция в хирургии. - 2004. - Т. 22. - С. 8-13; Гостищев В.К. Прогнозирование изменений прочности длинных трубчатых костей в хирургии хронического остеомиелита / В.К. Гостищев // Хирургия. - 2010. - №2. - С. 4-6). Термин «остеомиелит» принадлежит Рейно (1831). Не смотря на то, что в переводе с греческого «остеомиелит» означает воспаление только костного мозга, термин прочно вошел в хирургическую практику и используется для обозначения неспецифического гнойно-воспалительного процесса всех структур кости и окружающих мягких тканей (Акжигитов Г.Н. Остеомиелит / Т.Н. Акжигитов, В.Г. Галеев, В.Г. Сахаутдинов. - М., 1986. - 208 с.; Акжигитов Т.Н. Гематогенный остеомиелит / Г.Н. Акжигитов, Я.Б. Юдин. - М., 1998. - 287 с.; Никитин Г.Д. Хирургическое лечение остеомиелита / Г.Д. Никитин, А.В. Рак, С.А. Линник. - СПб., 2000. - 286 с.). Проблема лечения больных хроническим остеомиелитом продолжает оставаться одной из наиболее сложных и актуальных среди заболеваний костно-мышечной системы (Алексеев Д.Г. Хронический остеомиелит: особенности комплексного лечения на современном этапе / Д.Г. Алексеев, И.В. Ишутов, В.Е. Батаков // Молодые ученые здравоохранению региона: материалы науч. - практ. конф. - Саратов, 2005. - С. 237-238; Борисов И.В. Современные методы хирургического лечения остеомиелита длинных костей у взрослых: автореф. дис. … д-ра мед. наук / И.В. Борисов. - М., 2007. - 48 с.; Васильев С.Л. Реваскуляризирующие операции в лечении больных с хроническим остеомиелитом нижней конечности: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.01.17 / С.Л. Васильев. - Новосибирск, 2010. - 23 с.; Гостищев В.К. Инфекции в хирургии. Руководство для врачей / В.К. Гостищев. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 768 с.; Сонис А.Г. Результаты применения гравитационной терапии в лечении пациентов с остеомиелитом нижних конечностей / А.Г. Сонис // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. - 2010. - Т 3, №4. - С. 377-384). Это связано с особенностями локализации остеомиелитических полостей, тяжестью клинического течения патологического процесса, высокой частотой рецидивов заболевания. Больные нередко многократно подвергаются малоуспешным оперативным вмешательствам (Горюнов С.В. Гнойная хирургия: атлас / С.В. Горюнов, Д.В. Ромашов, И.А. Бутивщенко. - М., 2004. - 219 с.; Усик С.Ф. Остеомиелит: Клиника, диагностика, лечение / С.Ф. Усик, М.М. Федосеев, А.Н. Братийчук. - Саратов, 2007. - 96 с.; Bhavan K.Р. Hematogenous vertebral osteomyelitis / K.Р. Bhavan, N. Kinnani // Mo Med. 2009. - Vol 106, №4. - P. 277-82).

Повышение качества лечения связано с внедрением в практику новых методов и приемов лечения. Важным этапом их разработки является экспериментальное исследование, в основе которого лежит моделирование патологического процесса на животных.

Известен способ моделирования остеомиелита С.М. Дерижанова (Венгеровский И.С. Остеомиелит у детей / И.С. Венгеровский. - Москва, 1964. - 271 с.). Модель основана на предварительной сенсибилизации животного аллогенным белком, с последующим вызыванием асептического воспаления кости путем поколачивания деревянной палочкой по надкостнице. Автор вызывал сенсибилизацию кроликов лошадиной сывороткой. Затем, вводя решающую дозу сыворотки в костномозговую полость, получал асептический аллергический остеомиелит в месте нанесения травмы. Исходя из этих опытов, С.М. Дерижанов полагал, что бактериальные эмболы не играют никакой роли в патогенезе остеомиелита. Заболевание развивается только на почве сенсибилизации организма и возникновения в кости асептического воспаления, наступающего от самых разных причин. Недостатками этой модели являются невысокая производимость, осложнения в виде септического процесса в различных органах, вызванного большой дозой введенных микроорганизмов (несколько миллиардов микробных тел). Кроме того, сенсибилизация аллогенным белком вызывала также изменения со стороны иммунной системы, не связанные с патологическим процессом.

Известен способ моделирования Стецулы В.И. и Штин В.П. (Венгеровский И.С. Остеомиелит у детей / И.С. Венгеровский. - Москва, 1964. - 271 с.). Эксперименты проводились на беспородных собаках. Авторы заполняли просвет главной питающей артерии плечевой кости собак 50% взвесью металлического серебра в 2% растворе желатины. В последствии, получали закупорку внутрикостных сосудов. Это приводило к распространенному некрозу кости с последующим ее склерозом. Недостатком данной модели является то, что обязательна закупорка всей сосудистой системы, питающей кость. Это не позволяет использовать данную модель для экспериментальных исследований по лечению остеомиелита.

Известен способ моделирования хронического остеомиелита (патент РФ №2049434), осуществляемый следующим образом. Объектом для эксперимента была выбрана большеберцовая кость собаки. Через середину диафиза большеберцовой кости, используя технику чрескостного остеосинтеза, проводили активатор, им служила хирургическая спица Киршнера, которая в дальнейшем являлась положительным электродом (анодом). Катодом в предлагаемом эксперименте могут служить вторая спица, проведенная через этот же сегмент, аппарат чрескостной фиксации, электрод, установленный накожно. Источником тока служит батарея напряжения 1,5 В, сила тока 50 мА. Спицу вводили через сквозное отверстие под углом 60 градусов к оси канала, а инфицирующий материал вводили в место пересечения спицы и оси костномозгового канала через дополнительное отверстие в кортикальном слое кости. Недостатками данного способа является то, что он громоздок и отличается сложностью технического исполнения.

Наиболее близким к предлагаемому является способ моделирования Пономарева И.П. и соавторов (Пономарев И.П. Разработка экспериментальной модели хронического остеомиелита / И.П. Пономарев, Д.В. Максименко, Е.В. Алиева // Труды СГМА. - Смоленск, 2004. - С. 58), которые выполняли исследование на 30 половозрелых кроликах породы «шиншилла» массой 3,0-3,5 кг и 36 нелинейных белых крысах массой 200-250 г. Моделирование хронического остеомиелита включало два этапа: создание морфологического субстрата патологического процесса - костной полости с зоной перифокального склероза и секвестрами и ее инфицирование. В качестве склерозирующего предложен 20% спиртовой раствор нитрата серебра. Под наркозом в асептических условиях создавали полость в метаэпифизарной зоне одной из костей предплечья, в которую вносили турунду, смоченную раствором нитрата серебра, и фрагменты аутокости. В результате асептического воспаления на 15-30 сутки формировалась зона перифокального склероза. В полученную полость вводили культуру золотистого стафилококка в физрастворе. В течение 2-3 недель у большинства животных развивался хронический остеомиелит с характерной клинической и рентгенологической картиной. Недостатком данной модели является длительность эксперимента, а также то, что при контакте с окружающими мягкими тканями 20% спиртового раствора нитрата серебра возникает их выраженный склероз, что способствует дальнейшему развитию инфекции в мягких тканях.

Техническим результатом предлагаемого способа является моделирование длительного, бурно протекающего остеомиелитического процесса, сопровождающегося свищами, и возможность его поддержания столь длительное время, которое необходимо для изучения и объективной оценки процесса, для получения средств и методов его лечения.

Указанный технический результат достигается за счет того, что авторами впервые предложено использование этоксисклерола для образования зоны перифокального склероза с последующим введением в полость культуры золотистого стафилококка, замурованного в специальном растворе.

Способ осуществляют следующим образом.

Для моделирования хронического остеомиелита были выбраны здоровые белые лабораторные крысы, что обусловлено их восприимчивостью к моделированию хронического остеомиелита, удобством в обращении. При проведении экспериментальных исследований строго соблюдались правила лабораторной практики Российской Федерации (приказ МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г.), принципы, изложенные в приказе Минздрава СССР №755 от 12 августа 1977 года «О мерах по дальнейшему совершенствованию форм работы с использованием лабораторных животных» и в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986).

Моделирование хронического остеомиелита включало создание костной полости с зоной перифокального склероза с последующим инфицированием.

Под наркозом («Золитил-100» в дозе 8 мк/кг /согласно инструкции производителя/) в асептических условиях лабораторным животным на выбритом от шерсти участке наружной поверхности нижней трети бедра одноразовым медицинским скальпелем производят линейный разрез кожи, подкожной жировой клетчатки, фасции и мышцы длиной 1,5 см, обнажается метаэпифизарная зона бедренной кости, где с помощью ручного микромоторного хирургического инструмента с защитным устройством создается полость диаметром 3,5 мм. После этого в полость вносится турунда, смоченная 1% раствором этоксисклерола (действующим веществом этоксисклерола является лауромакрогол 400, вызывающий склероз эндотелия), и фрагменты аутокости. На кожу накладывается один наводящий шов шелковой нитью размером 1,0.

На 7-е сутки иссекается послеоперационный рубец, тупым способом раздвигаются мышцы, мягкие ткани отводятся с помощью однозубых крючков и в полученную полость с помощью иглы Кассирского вносится кусочек суточной культуры золотистого стафилококка в 2% агар-агаре, содержащий около 150-200 тысяч микротел. С целью предотвращения развития гнойной инфекции мягких тканей отверстие в кости запломбировывают эркодонт-цементом, рану засыпают порошком амоксиклава в дозе 500 мг.

Каждый раз для моделирования хронического остеомиелита используется один и тот же штамм Staphilococcus aureus.

Приготовление микробной культуры заключается в следующем: из суточной культуры Staphilococcus aureus, выращенной на кровяном агаре, готовится взвесь в стерильном физиологическом растворе (рН 7,2) с концентрацией микробных клеток 10⁸ CFU/МЛ по оптическому стандарту мутности; 1 мл 2% расплавленного и остуженного до 50° агар-агара смешивали в пробирке с 1 мл взвеси суточной культуры Staphilococcus aureus (4 млрд микротел).

На 31-е сутки после внесения микробной культуры развивается хронический остеомиелит. В 100% случаев формируются свищи с отделением гнойного экссудата.

Развитие хронического остеомиелита подтверждалось клиническими, лабораторными, рентгенологическими и морфологическими данными.

Оценка клинических данных показала, что у животных отмечалось истощение, снижение аппетита, угнетение общего состояния, слабая двигательная активность, наблюдалась выраженная ломкость шерстного покрова. Отмечалась бледность и сухость слизистых оболочек. Функционировали свищи, вокруг которых определялась зона интенсивной гиперемии, повышение местной температуры. Из свищевых ходов выделялось умеренное количество гнойного экссудата сметанообразной консистенции.

Среди лабораторных показателей оценивали уровень гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты.

У лабораторных животных отмечено снижение уровня гемоглобина и эритроцитов. Уровень гемоглобина составил 104,57±2,99 г/л. Показатели уровня эритроцитов соответствовали количественным изменениям числа гемоглобина и составляли 4,25±0,03×10¹²/л. Отмечающаяся анемия носила токсический характер и ассоциировалась с хроническим процессом.

На фоне выраженного гнойного процесса показатель лейкоцитов соответствовал 13,00±0,24×10⁹/л. Течение патологического процесса сопровождалось изменениями в лейкоцитарной формуле. Происходило увеличение количества палочкоядерных, сегментоядерных нейтрофилов, а также умеренный сдвиг лейкоцитарной формулы влево, моноцитоз и лимфопения. У животных содержание палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов составляло 6,00±1,29% и 64,14±1,35% соответственно. Данные изменения сопровождались умеренным моноцитозом (2,57±0,98%), свидетельствующим о наличии гнойно-некротического процесса в тканях, и лимфопенией (27,29±2,06%), указывающей на иммунодефицит при тяжело и длительно протекающем инфекционно-воспалительном процессе.

Отмечалось повышение СОЭ, этот показатель у интактных крыс более чем втрое и составил 6,57±1,27 мм/час.

Среди показателей процессов свободнорадикального окисления, лежащих в основе метаболизма всех клеток и определяющих адаптивную состоятельность организма к действию повреждающих факторов, оценивали перекисное окисление (модификацию) липидов и белков.

В качестве показателя активности перекисного окисления липидов определяли малоновый диальдегид, являющийся конечным продуктом свободнорадикального окисления липидов и образующийся при окислительной деструкции липидных гидропероксидов.

Степень окислительной модификации белков (ОМБ) оценивали по содержанию карбонильных групп в реакции с 2,4-динитрофенилгидразином, которые образуются в основном в результате прямого окисления некоторых аминокислотных остатков свободными радикалами, а также при взаимодействии с продуктами ПОЛ.

В ходе проведенных исследований было констатировано, что у лабораторных животных уровень МДА составил 42,52±5,19 нмоль/л. Это в 2,9 раза превысило данный показатель у интактных животных и свидетельствовало об интенсификации процессов ПОЛ. В результате активации ПОЛ и накопления свободных радикалов происходит окислительная модификация липопротеинов плазмы крови, нарушение структурно-функциональной целостности клеточных мембран, освобождение лизосомальных ферментов.

При исследовании окислительной модификации белков, играющей ключевую роль в молекулярных механизмах окислительного стресса и являющейся пусковым механизмом окислительной деструкции других молекул, констатировали увеличение уровня 2,4-динитрофенилгидразонов (ДНФГ) до 80,36±3,22 нм/мг белка.

Строгая регламентация реакций СРО достигается за счет функционирования согласованной системы ферментативных и неферментативных механизмов контроля за содержанием активных форм кислорода, свободными радикалами и молекулярными продуктами СРО.

Супероксиддисмутаза занимает центральное место в системе ферментативной антиоксидантной защиты организма. Одним из показателей неферментативного звена являются сульфгидрильные группы.

В ходе проведенных исследований было констатировано повышение уровня SH-групп. Однако данная активация неферментативного звена АОС была недостаточной для ингибирования свободнорадикальных процессов. Уровень SH-групп составил 107,45±3,12 мг. Наблюдалось статистически достоверное снижение уровня ферментативного звена АОС. Содержание СОД составило 0,40±0,03 усл.ед. Происходил дисбаланс физиологического оксидант-антиоксидантного равновесия.

Рентгенологически у лабораторных животных мягкие ткани бедра пораженной конечности увеличены в объеме. Кость утолщена за счет периостальных наслоений. Обнаружены очаги деструкции с неровными склерозированными стенками. На фоне зоны остеопороза со склеротическим ободком визуализируются участки повышенной плотности 0,2-0,4 см в диаметре - секвестры в секвестральной коробке. Костномозговой канал склерозирован.

При морфологической оценке обнаруживаются участки рыхлой неоформленной соединительной ткани между секвестрами. Клеточный компонент представлен в основном клетками воспалительного ряда. Распространяясь в межтрабекулярных пространствах, воспалительный инфильтрат вызывает изменения рН. Ацидоз, локальный отек и активность лейкоцитов усиливают некротизацию костной ткани. На фоне распространения воспаления через гаверсовы и питательные каналы развивается тромбоз сосудов, проходящих в них. Сосудистая обструкция еще больше усиливает некротизацию крупных участков кости. Имеются секвестры, содержащие значительное количество трабекул с многочисленными остеобластами. Отмечается наличие секвестров в окружении полости с гнойно-некротическим содержимым. От данной полости идут свищевые ходы, достигая надкостницы. Нарушение целостности надкостницы вызывает формирование абсцессов в окружающих мягких тканях.

Выявление гиалуроновой кислоты показало, что костные балки в зоне очага, содержат умеренное количество клеток округлой или овальной формы с короткими отростками, с цитоплазмой насыщенной гиалуроновой кислотой (ГК). Межклеточной вещество балок содержит много ШИК-положительный волокон. В препаратах определяется разрастание фрагментов старой кости, практически лишенные ГК и нейтральных мукополисахаридов (НПС), имеются фрагменты, клеточные элементы которых имеют сильно вакуолизированную цитоплазму и лишены четко определенного ядра. Надкостница фрагментов старой кости содержит значительное количество мелких ГК-положительных клеток и волокон. В области костного дефекта определяется обширная, рыхлая масса ГК-положительных и ШИК-положительных волокон, перемежающихся мелкими клетками с узким ободком ГК-положительной цитоплазмы.

Таким образом, получена новая модель хронического остеомиелита, отвечающая современным требованиям и характеризующаяся морфологическими изменениями кости, соответствующими таковым у человека, а также хорошей производимостью, отсутствием генерализации инфекции и летальности, низкой стоимостью эксперимента. Эксперимент дал возможность наблюдать и изучать течение болезни, позволил контролировать исходное состояние объектов опыта.

Теоретическое обоснование разработанного способа осуществлены на базе НИИ ЭБМ ГБОУ ВПО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России.