Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРОВАННЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS FRANCISELLA TULARENSIS 1D6 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЛИПОПОЛИСАХАРИДУ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА

Изобретение относится к области микробиологии и гибридомной биотехнологии и может быть использовано при создании иммунодиагностических тест-систем на основе моноклональных антител (МКА) для выявления возбудителя туляремии в биологическом материале и объектах окружающей среды.

Крупные вспышки и спорадические случаи туляремии, относящейся к особо опасным возвращающимся инфекционным болезням, периодически регистрируются во многих странах мира, в том числе в России [3, 8]. Сохранение эпизоотически активных природных очагов, вероятность применения Francisella tularensis при биотеррористических актах [5, 7], сложность постановки клинического диагноза обусловливают необходимость совершенствования лабораторной диагностики этой инфекции. Несмотря на многообразие разрабатываемых методов на практике предпочтение, как правило, отдается иммунодиагностическим, характеризующимся экспрессностью, высокой специфичностью и чувствительностью, а также ввиду возможности их использования для исследования материала, непригодного для бактериологического анализа [2, 3, 4].

В настоящее время в нашей стране выпускаются только поликлональные туляремийные диагностикумы, в связи с чем, безусловно, актуальными являются исследования, направленные на получение МКА к F. tularensis для конструирования иммунодиагностических тест-систем. При этом особое значение приобретает селекция гибридом, перспективных в качестве производственных линий.

Важный аспект конструирования современных диагностикумов - замена поликлональных иммунореагентов моноклональными, которые можно получить в виде стандартного чистого химического реагента и в практически нелимитированном количестве [1, 6].

Известен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus F. tul. 11D6 - продуцент моноклональных антител, специфичных к липополисахариду (ЛПС) Francisella tularensis, титр которых составляет в культуральной жидкости 1:1000, в иммуноасцитической жидкости - 1:100000, и которые могут быть использованы для конструирования тест-систем, выявляющих возбудитель туляремии (патент 2451078).

Задачей изобретения является получение штамма гибридомы-продуцента высокоспецифичных МКА, предназначенных для использования в качестве иммунореагентов при конструировании иммунодиагностических тест-систем с целью выявления возбудителя туляремии в биологическом материале и объектах окружающей среды.

Поставленная задача решается получением штамма гибридных клеток животных Mus musculus Francisella tularensis. 1D₆ (F. tul. 1D₆) - продуцента моноклональных антител к боковым полисахаридным цепям липополисахарида туляремийного микроба.

Заявляемый штамм гибридных клеток животных F. tul. 1D₆ получают путем гибридизации спленоцитов иммунной мыши линии BALB/c с клетками мышиной миеломы Sp 2/0 в присутствии сливающего агента - полиэтиленгликоля (ПЭГ), последующего рассева взвеси клеток в лунки 96-луночных культуральных планшетов, выращивания на селективных средах с постепенным переходом на полную среду культивирования гибридных клеток, отбора первичного клона по показателю продукции специфических антител, его клонирования и реклонирования методом лимитирующих разведений.

Штамм гибридных клеток животных F. tul. 1D₆ характеризуется следующими признаками:

Маркерные признаки и методы их оценки

Штамм секретирует мышиные иммуноглобулины, специфичные в отношении F. tularensis. Анализ мышиных иммуноглобулинов проводят методом иммуноферментного анализа, используя в качестве антигена препарат ЛПС, экстрагированный из вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ классическим водно-фенольным методом [9], и антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой хрена.

Контаминация бактериями и грибами не обнаружена.

Морфологические признаки

Культура состоит из крупных округлых клеток, сходных по морфологии и размерам с клетками исходной родительской миеломы Sp 2/0.

Культуральные свойства

Соматические клетки инкубируют при 37°C в атмосфере с 5% CO₂ в пластиковых 96-луночных планшетах. Культивирование клеточных линий проводят в ростовой среде следующего состава: гибридомная среда RPMI 1640 с добавлением 10% NaHCO₃, 2% HEPES, 2% L-глутамин, дополненная антибиотиками (пенициллин, стрептомицин, гентамицин, амфотерицин), а также 3% лошадиной сыворотки («РАА», Австрия) (для миеломных клеток) или 10% эмбриональной сыворотки плода коровы («РАА», Австрия) (для гибридом).

На всех этапах гибридизации иммунных спленоцитов с клетками мышиной плазмацитомы применяют бессывороточную среду RPMI 1640 с вышеуказанными ингредиентами. Эта же среда использовалась для приготовления раствора сливающего агента - ПЭГ 4000. Для этого 1 г ПЭГ автоклавировали при 110°C 30 мин и растворяли в 1 мл среды непосредственно перед фузией.

Селективная среда состоит из среды для культивирования гибридом, дополненной 50-кратным раствором гипоксантин-аминоптерин-тимидин (HAT) или гипоксантин-тимидин (НТ). Для растворения HAT или НТ использовали деионизованную воду, которую стерилизовали, используя мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. После неоднократного скрининга для накопления препаративного количества гибридных клеток синтезируемых моноклональные антитела дальнейшее культивирование продолжали на гибридомной среде.

Штамм является монослойно-суспензионной культурой, в которой до 15% клеток находится в суспензии, не прикрепляясь к поверхности посуды для культивирования. Посевная доза - 10⁵ кл/мл. Частота пассирования 2-3 суток.

Культивирование штамма гибридных клеток 1D₆ в организме животного

8-12 недельным мышам весом 20 г инбредной линии BALB/c, сингенных по отношению к линиям плазмацитомы Sp.2/0-Ag.8, предварительно праймированных 0,5 мл пристана, вводят внутрибрюшинно 2×10⁶ гибридных клеток. Формирование асцитных опухолей регистрируют у 100% биопродуцентов в одни и те же сроки (на 8-9 день). В среднем объем иммуноасцитической жидкости от одной мыши составил 5,6±0,5 мл при средней концентрации 1,8×10⁶ м.к. в 1 мл.

Антителопродуцирующая активность, которая определялась непрямым иммуноферментным анализом, в течение 1 года сохранялась на постоянном уровне и хорошо воспроизводилась и в культуре клеток, что свидетельствовало о стабильности основных свойств штамма F. tul. 1D₆ как in vivo, так и in vitro.

Характеристика полезного продукта. Штамм гибридных клеток F. tul. 1D₆ продуцирует МКА к эпитопу липополисахарида F. tularensis, титр которых составляет в культуральной жидкости 1:640 - 1:1280, в иммуноасцитической жидкости - 1:5120 - 1:10240. Иммуноглобулиновую фракцию выделяли двукратным осаждением насыщенным до 45-50% раствором сульфата аммония. Концентрацию иммуноглобулинов определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм.

Продуктивность штамма. Продукция МКА в среде культивирования составляет 34-50 мкг/мл, в асцитической жидкости - 8-12 мг/мл. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении 6 пассажей in vitro и 10 пассажей in vivo (срок наблюдения).

Криоконсервация. В период, когда эксперименты по накоплению препаративных количеств МКА 1D₆ не проводились, линии плазмацитом и позитивные клоны гибридных клеток сохраняли в пробирках для криоконсервирования с фетальной сывороткой и добавлением в качестве криопротектора 10% диметилсульфоксида при температуре минус 196°C в сосудах Дьюара с жидким азотом. Размораживание производили при 37°C на водяной бане в течение 2-3 минут. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет не менее 75%.

Свойства полезного продукта. Изотипирование полученного МКА проводили с помощью набора «Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents» (Sigma, США) по прилагаемой инструкции изготовителя. Гибридома F. tul. 1D₆ продуцирует МКА, относящиеся к иммуноглобулинам класса G.

Штамм гибридных клеток F. tul. 1D₆ - продуцент МКА изотипа G к боковым полисахаридным цепям липополисахарида туляремийного микроба получен в Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» Роспотребнадзора и депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером Н-42.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1. Получение штамма гибридных клеток животных F. tul. 1D₆.

Штамм получают гибридизацией спленоцитов гипериммунных мышей BALB/c с миеломными клетками Sp.2/0-Ag.8, дефектными по синтезу фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе. Для иммунизации мышей линии BALB/c оптимальной оказалась схема, состоящая из двух циклов, предусматривающая 5-кратное внутрибрюшинное введение препарата с 2-недельным интервалом и перерывом в 1 месяц между циклами.

По завершении циклов иммунизации титры специфических антител в сыворотках животных определяли непрямым твердофазным иммуноферментным анализом.

Гибридизация. За два дня до слияния осуществляли бустерную прививку антигена иммунизированным мышам, а также подготавливали 96-луночные планшеты с фидерным слоем клеток. Гибридизацию иммуноспленоцитов мыши и клеток миеломы проводили в соотношении 1:5 в присутствии 1 мл полиэтиленгликоля 4000 в течение 1 минуты.

Селекция. После отмывки полиэтиленгликоля клетки высевали на 96-луночные планшеты с фидерным слоем. На первом этапе после гибридизации использовали селективную НАТ-среду. Через 5-7 дней с помощью инвертированного микроскопа наблюдали рост клонов гибридных клеток. Начиная с 14 дня после слияния, культивирование гибридом осуществляли на среде с НТ, через 5-7 дней переводили на ростовую среду без селективных компонентов.

Скрининг гибридных клонов. Для отбора гибридом-продуцентов МКА к специфическим эпитопам на 14-й день после проведения гибридизации культуральную жидкость лунок с пролиферирующими клонами тестировали на наличие антителопродуцирующих гибридом в непрямом иммуноферментном анализе. Лунки полистироловых планшетов для ИФА сенсибилизировали ЛПС туляремийного микроба в концентрации 10 мкг/мл. Планшеты инкубируют при температуре 37°C в течение 2 часов или при температуре 4°C в течение 16-18 часов.

По истечении времени инкубации лунки блокировали 0,5% раствором сухого обезжиренного молока в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и выдерживали при температуре 37°C в течение 30 мин. После удаления блокирующего раствора, трижды промывали лунки ФСБ, далее вносили культуральную жидкость из тех лунок, где количество клеток покрывает 1/3 дна лунки. Планшеты инкубировали при температуре 37 С в течение 1 часа. Затем лунки планшетов трижды промывали ФСБ и вносили раствор антивидового конъюгата «Антитела диагностические против Ig G (H+L) белой мыши», меченных пероксидазой в рабочем разведении. В качестве разводящей жидкости использовали 0,5% раствор твина-20 в ФСБ и 0,5% раствор лактальбулина в соотношении 1:9. Планшеты инкубировали при температуре 37°C в течение 1 часа. Удаляли встряхиванием жидкость из лунок и отмывали 6-кратно. Затем в каждую лунку планшетов вносили по 100 мкл субстрат-индикаторной смеси. Планшет помещали на шейкер и выдерживали 30 мин при легком встряхивании. Учет результатов проводили спектрофотометрически, определяя оптическое поглощение при длине волны 405 нм.

Клонирование. Гибридомы с максимальными и стабильно регистрируемыми значениями оптической плотности были отобраны для проведения клонирования методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах с фидерным слоем клеток. Скрининг клонов осуществляли в непрямом иммуноферментном анализе, как описано выше.

Криоконсервация. Линии плазмацитом и позитивные клоны гибридных клеток сохраняют в пробирках для криоконсервирования с фетальной сывороткой и добавлением в качестве криопротектора 10% диметилсульфоксида при температуре минус 196°C в сосудах Дьюара с жидким азотом.

Пример 2. Культивирование штамма гибридных клеток F. tul. 1D₆, секретирующего МКА к ЛПС туляремийного микроба.

Мышам весом 18-20 г инбредной линии BALB/c через 14 дней после обработки пристаном вводили внутрибрюшинно гибридные клетки в дозе 2⋅10⁶ на одну мышь. Формирование асцитных опухолей отмечалось у 100% биопродуцентов в одни и те же сроки (на 8-9 день). В среднем объем иммуноасцитической жидкости от одной мыши составил 5,6±0,5 мл при концентрации клеток 1,8⋅10⁶ в 1 мл. Оба показателя характеризовались приблизительно одинаковыми значениями во всех пассажах. Клетки из асцитической жидкости могут использоваться для дальнейшего перевивания, либо храниться в криоконсервированном состоянии, а в надосадочной жидкости определяли титр антител с помощью иммуноферментного анализа, как описано выше.

Пример 3. Определение продуктивности клона в культуральной и иммуноасцитической жидкостях.

Лунки полистиролового планшета для ИФА сорбировали ЛПС в концентрации 10 мкг/мл. Планшет инкубировали при температуре 37°C в течение 2 часов или при температуре 4°C в течение 16-18 часов.

По истечении времени инкубации лунки блокировали 0,5% раствором сухого обезжиренного молока в ФСБ. Инкубировали при температуре 37°C в течение 30 мин. После удаления блокирующего раствора трижды промывали лунки ФСБ. Испытуемые культуральную и иммуноасцитическую жидкости титровали, начиная с разведения 1:10 и 1:20 соответственно, до 12-ой лунки, последовательно перенося по 100 мкл жидкости из каждой предыдущей лунки в последующую. Планшет инкубировали при температуре 37°C в течение 1 часа. Затем лунки планшета трижды промывали ФСБ и вносили раствор антивидового конъюгата «Антитела диагностические против Ig G (H+L) белой мыши», меченных пероксидазой в рабочем разведении. В качестве разводящей жидкости использовали 0,5% раствор твина-20 в ФСБ и 0,5% раствор лактальбулина в соотношении 1:9. Планшет инкубировали при температуре 37°C в течение 1 часа. Удаляли встряхиванием жидкость из лунок и отмывали 6-кратно. Затем в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл субстрат-индикаторной смеси. Планшет помещали на шейкер и выдерживали 30 мин при легком встряхивании.

В лунках планшета, где прошла реакция, появляется окрашивание от насыщенно-зеленого до светло-зеленого. Интенсивность окрашивания снижается по мере снижения концентрации внесенных специфических антител. В лунках, не содержащих специфических антител, цвет субстрата бесцветный или слабоокрашенный. Продуктивность клона в культуральной и иммуноасцитической жидкостях составила 34-50 мкг/мл и 8-12 мг/мл соответственно.

Пример 4. Выделение очищенных моноклональных антител, продуцируемых штаммом гибридных клеток F. tul. 1D₆.

Выделение иммуноглобулиновой фракции осуществляли двукратным осаждением насыщенным раствором сульфата аммония до 45-50% насыщения. Для этого асцитическую жидкость, которую предварительно центрифугировали при 800 об/мин, разводили в 2 раза дистиллированной водой и проводили первое насыщение насыщенным раствором сульфата аммония до 45%, оставляли на ночь при 4°C. На следующий день после центрифугирования проводили второе насыщение насыщенным раствором сульфата аммония до 50%, также оставляли на ночь при 4°C. Освобождение иммуноглобулиновой фракции от сернокислого аммония проводили с помощью диализа против физиологического раствора.

Пример 5. Определение специфического взаимодействия и чувствительности иммуноглобулиновой фракции штамма гибридных клеток F. tul. 1D₆ с ЛПС туляремийного микроба в иммуноферментном анализе.

Для проведения неспецифической сорбции в лунки полистиролового планшета вносили МКА в концентрации 30 мкг/мл. Планшеты инкубировали при температуре 37°C в течение 2 часов или при температуре 4°C в течение 16-18 ч. По истечении времени инкубации раствор MICA, удаляли и блокировали 0,5% раствором лактальбумина, выдерживая планшет в термостате при температуре 37°C в течение 30 мин. В первую лунку титрационного ряда вносили 200 мкл, а в остальные - по 100 мкл. Затем в первую лунку вносили ЛПС в количестве 0,5 мг и последовательно переносили, предварительно перемешивая, по 100 мкл содержимого лунки. Планшет выдерживали в термостате при температуре 37°C в течение 1 часа. Далее лунки планшета трижды промывали ФСБ и вносили раствор конъюгата пероксидазного иммуноглобулинового моноклонального в рабочем разведении. После инкубации при температуре 37°C в течение 1 часа лунки планшета 6-кратно промывали ФСБ и вносили субстратную смесь. Реакцию учитывали фотометрически при длине волны 405 нм по изменению окраски в лунках. Для этого рассчитывали среднее арифметическое значение в лунках с отрицательным контрольным образцом - ОПср(К-). Результат анализа считали положительным, если ОПобр ≥ ОПср(К-) × 2. Результат анализа считали отрицательным, если ОПобр < ОПср(К-) × 2 (ОПобр - оптическая плотность в лунке с анализируемым образцом).

По результатам анализа, специфическая чувствительность моноклональных антител штамма гибридных культивируемых клеток животных F. tul. 1D₆ при взаимодействии с ЛПС туляремийного микроба составила 7,8 мкг/мл, что превосходит известные аналоги.

Таким образом, заявляемый штамм гибридных культивированных клеток животных F. tul. 1D₆ обеспечивает получение иммуноглобулинов, специфичных в отношении ЛПС туляремийного микроба, относящихся к иммуноглобулинам класса G. Очищенные моноклональные антитела специфически взаимодействовали с препаратом ЛПС туляремийного микроба в иммуноферментном анализе, чувствительность которого составила 7,8 мкг/мл.

Список литературы

1. Кэтти Д., Антитела. Методы. [Текст] / Д. Кэтти // М: Мир; 1991. - 287 с.

2. Методические указания «Эпидемиологический надзор за туляремией». - МУ 3.1.2007-05.

3. Никифоров В.В., Кареткина Т.Н. // Инфек. болезни. - 2007. - Т. 5. - №1. - С. 67-76.

4. Фримель Г. Иммунологические методы. [Текст] / Г. Фримель // М.: Медицина, 1987. - 415 с.

5. Broussard L.A. // Mol. Diagn. - 2001. - Vol. 6, N 4. - P. 323-333.

6. Peruski A.H., Peruski L.F., Jr. Immunological methods for detection and identification of infectious disease and biological warfare agents // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 2003. - 10(4). - P. 506-513.

7. Robinson-Dunn B. // Arch. Pathol. Lab. Med. - 2002. - Vol. 126, N 3. - P. 291-294.

8. Splettstoesser W.D., Tomaso H., Al Dahouk S. // J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health. - 2005. - Vol. 52, N 6. - P. 249-261.

9. Westphal, O. Uber die extraktion von bakterien mit phenol/wasser // Z. Naturforsch. - 1952. - B. 7. - P. 148-155.