Штамм Trichoderma asperellum - продуцент гидролитических ферментов и пептидных метаболитов и его применение

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, биологии, сельского хозяйства, животноводства. Штамм грибка Trichoderma asperellum F-1087 может быть использован в биотехнологиях как продуцент комплекса гидролитических ферментов и биологически активных метаболитов, как штамм, обладающий антибактериальной, противоопухолевой, фунгицидной, ферментативной активностями. Кроме указанного экспериментально выявлена возможность использования в области медицины, в качестве перспективного лекарственного средства для подавления активности противоопухолевых клеток человека, в биотехнологии, в сельском хозяйстве и животноводстве.

Известно изобретение [1], в основе которого находится штамм микромицета Trichoderma hamatum, обладающий антибактериальной активностью в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis. Недостатком [1] является происходящее через некоторое время проявление резистентности к возбудителю сибирской язвы Bacillus anthracis, вследствие чего полученный с применением этого штамма лекарственный препарат теряет свои свойства, т.е. не может быть применен в качестве продуцента гидролитических ферментов и пептидных метаболитов и, как следствие, не пригоден для производства указанных гидролитических ферментов в промышленных масштабах. Недостаток ограничивает область применения [1].

Известен [2] штамм Trichoderma harzianum rifai - продуцент ингибитора вируса кольцевой пятнистости табака. Указанный штамм предназначен исключительно для производства одного вида фермента, и, как следствие, не может быть применен в биотехнологиях как продуцент комплекса гидролитических ферментов и биологически активных метаболитов, в лабораторных и промышленных масштабах

Известен [3] штамм Trichoderma asperellum 302, выделенный при археологических раскопках и проявляющий противоопухолевые свойства, открывающий новые возможности и перспективы использования активных веществ, получаемых из грибов. Недостатком [3] является ограниченность его применения как продуцента комплекса гидролитических ферментов и биологически активных метаболитов, в лабораторных и промышленных масштабах. Недостаток существенно ограничивает область применения аналога [3].

Наиболее близким по существу заявленного технического решения, выбранного заявителем в качестве прототипа, является штамм гриба Trichoderma lignorum [4], используемый для производства триходермина, применяемого в растениеводстве для борьбы с фитопатогенами. Недостатком известного технического решения является низкая эффективность получения целевого продукта-триходермина, вследствие чего указанный штамм не пригоден в качестве продуцента комплекса гидролитических ферментов и биологически активных метаболитов, в лабораторных и промышленных масштабах. Кроме того, недостатками являются: ограниченность перечня используемых в производстве питательных сред - штамм [4] культивируют с использованием только твердофазной питательной среды культивирования; штамм не обладает активностью против распространенного среди сельхозкультур фитопатогена Pseudomonas corrugata. Недостатки ограничивают область применения прототипа [4].

Целью заявленного технического решения является получение штамма-продуцента расширенного комплекса гидролитических ферментов и/или комплекс вторичных пептидных метаболитов широкого спектра действия при культивировании на целевых питательных средах, повышение выхода целевого продукта, расширение области применения продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Сущностью заявленного технического решения является штамм Trichoderma asperellum F-1087 - продуцент гидролитических ферментов и пептидных метаболитов, обладающий антибактериальной, противоопухолевой, фунгицидной, ферментативной активностями, штамм Trichoderma asperellum F-1087 по п. 1 - применяемый в области медицины в качестве перспективного лекарственного средства для подавления активности противоопухолевых клеток человека.

Указанный штамм депонирован в ФГУП ГоссНИИ Генетика, во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ВКПМ под регистрационным номером F-1087.

Штамм Trichoderma asperellum F-1087 выделен из внутренней части человеческого черепа, обнаруженного во время археологических раскопок на Мурзихинском II могильнике в почве Алексеевского района республики Татарстан. Хранится в музее лаборатории сельскохозяйственной биохимии и биотехнологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета (сокращ. - КФУ), г. Казань и в ВКПМ, г. Пущино, Московская область.

Штамм Trichoderma asperellum F-1087 охарактеризован в лаборатории молекулярно-генетического анализа кафедры биохимии КФУ.

Штамм Trichoderma asperellum F-1087 характеризуется приведенным далее способом (методом) выращивания и отличительными свойствами:

Культурально-морфологические особенности штамма

Колонии гриба, выращенные на питательной среде картофельно-глюкозного агара, при температуре плюс 30°С растут быстро, достигая из центра до краев чашки Петри диаметром 100 мм за 4-5 суток. При росте образуют до 5 цилиндрических колец с интенсивным спороношением. Мицелий бесцветный, стелющийся, паутинистый. Цвет мицелия от зеленого до темно-желтого. Спороношение появляется на 4-6 сутки роста, в центральной части колонии более темные концентрические кольца, по мере удаления от центра к краю кольца становятся светлее. Обратная сторона колонии бесцветная или слабовато-желтая. Пигмент в питательную среду не выделяется. Экссудат обычно отсутствует. Запах слабый грибной. Гифы бесцветные, гладкие, 2-4 мкм в диаметре, со вздутиями и толстостенными клетками. Хламидоспоры терминальные, интеркалярные, сферические или яйцевидные, бледно-зеленые, гладкие, от 4,5 до 15,0 мкм в диаметре. Спорангиеносцы бутылевидные, прямые, древовидно-разветвленные, чаще формируются в подушечках и редко в воздушном мицелии. Спорангиеносцы симметричные и завершаются двумя или более фиалидами. Ширина спорангиеносца преимущественно от 2,8 до 4,0 мкм. Конидии имеют темно-зеленый цвет, формы от шаровидных до сферических, или яйцевидных, мелко-шиповатые, размером 3,4-3,6 на 3,0-4,0 мкм. На питательной среде Чапека и SNA наблюдается бедный рост колонии.

Биохимические особенности штамма

Отношение к источникам углерода: хорошо усваивает глюкозу, крахмал. Растет на средах, содержащих галактозу, лактозу, сахарозу, крахмал. Не усваивает целлюлозу и хитин. Отношение к источникам азота - усваивает аммонийные формы азота и органический азот аминокислот. Восстанавливает нитраты.

Оптимальные условия и состав среды для культивирования штамма

Гриб растет в интервале значений рН от 2,5 до 9,5. Оптимальное значение рН 5,0. В более кислых условиях (рН 2,5-5,0) и в более щелочных (рН 7,0-9,5) изменяются морфологические характеристики культуры: замедлено спорообразование. Для культивирования штамма применимы плотные питательные среды: агар, сусло-агар, Чапека, SNA. Аэроб. Оптимальная температура для роста культуры гриба плюс 28-30°С, длительность культивирования до массовой споруляции - от 5 до 7 суток, в зависимости от состава среды и температуры культивирования. Нетоксичен для человека, теплокровных животных, пчел и земляных червей.

Условия хранения штамма

Штамм хранят в виде конидиальных спор на питательной среде PDA с добавлением 10-20%-го глицерина, при температуре минус 70°С.

Технический результат жизнедеятельности штамма гриба Trichoderma asperellum F-1087 заключается в его способности активно продуцировать комплекс гидролитических ферментов и пептидов, обладающих антибактериальной, противоопухолевой, ферментативной, фунгицидной активностями. Штамм гриба Trichoderma asperellum F-1087 хорошо растет на жидкой питательной среде, выделяет комплекс вторичных пептидных метаболитов широкого спектра действия, что является его преимуществом в сравнении с прототипом [4].

Заявляемый штамм Trichoderma asperellum F-1087 может быть использован для промышленного получения гидролаз и вторичных метаболитов, обладающих антибиотической, противоопухолевой, ферментативной, фунгицидной активностями, а также в качестве кормовой добавки для животных и птиц, для переработки послеспиртовой зерновой барды в корма для животных. Исследование ферментов из культуральной жидкости и мицелия плесневого гриба Trichoderma asperellum F-1087 показали, что они (ферменты) обладают ксиланазной, протеазной, целлюлазной активностями. Изучением механизмов действия определено, что выделенный комплекс вторичных пептидных метаболитов напрямую воздействует на клеточную стенку патогенных микроорганизмов, подавляя ее (микроорганизма) жизнедеятельность, что существенно отличает его (механизм действия штамма) от действия классических антибиотиков. Кроме указанного, следует акцентировать факт отсутствия у заявленного технического решения (выделенного комплекса вторичных пептидных метаболитов) образующейся со временем резистентности (устойчивости), в отличие от традиционно используемых антибиотиков.

Заявляемое изобретение иллюстрируется примерами.

ПРИМЕР 1. Получение гидролитических ферментов и комплекса вторичных пептидных метаболитов штамма Trichoderma asperellum F-1087

Получают посевной материал. Для получения посевного материала культуру гриба Trichoderma asperellum F-1087 ВКМ F-1087 выращивают известным методом глубинного культивирования на питательной среде Чапека состава (г/л): глюкоза - 30; NaNO₃ - 3; K₂HPO₄ - 1; MgSO₄ × 7H₂O - 0,5; KCl - 0, 5; FeSO4 × 7H₂O - 0,01; агар-агар - 15; H₂O - остальное.

Культивирование осуществляют при плюс 28°С, в темноте, в течение 168 часов (7 суток).

В жидкую питательную среду состава (г/литр): глюкоза - 5,000; KH₂PO4 - 0,800; KNO₃ - 0,700; CaCO₃ - 0,060; 70%-ная H₃PO₄ - 20 мкл; MgSO₄ - 0,500; ZnSO₄ - 0,010; CuSO₄ - 0,005; FeSO₄ - 0,001; MnSO₄ - 0,010 помещают агаровый блок с газоном выращенного на среде Чапека гриба. Культивирование осуществляют в качалочных колбах объемом V=1000 мл, содержащих 500 мл среды, например - при температуре +28°С, на подвесной качалке со скоростью вращения платформы 80 об/мин, в течение 288 час (12 суток). В процессе роста культуры контролируют условия (процесса): отсутствие посторонней микрофлоры, рН, продуктивность, морфологическое состояние культуры. При нарушении условий культивирования процесс начинают заново.

Культуральную жидкость гриба профильтровывают через стерильный марлевый слой и центрифугируют, например - при 5000 об/мин в течение 15 мин. Отобранную часть (надосадок) смешивают с экстрагирующей средой, например этилацетатом, и экстрагируют и получают заявляемый комплекс вторичных пептидных метаболитов.

Комплекс вторичных пептидных метаболитов представляет собой подобную воде бесцветную прозрачную жидкость легче воды по плотности, с запахом экстрагирующей среды, нерастворимую в воде. Полученный комплекс вторичных пептидных метаболитов помещают в закрываемую емкость, хранят в холодильной камере при температуре от минус 18 до минус 24°С и используют по потребности, например после предварительного размораживания.

Комплекс вторичных пептидных метаболитов с помощью гель-фильтрационной хроматографии разделяют на отдельные пептидные компоненты масс-спектрометрическим методом идентифицируют (определяют) выделенные вторичные метаболиты жизнедеятельности штамма Trichoderma asperellum F-1087. Отдельные пептидные компоненты исследуют, хранят и употребляют по целевым назначениям.

ПРИМЕР 2. Определение противоопухолевой активности

Совершая действия по ПРИМЕРУ 1, выделяют комплекс вторичных пептидных метаболитов штамма Trichoderma asperellum F-1087.

Противоопухолевую активность исследуют с использованием МТТ-теста на определение жизнеспособности выживания опухолевых (раковых) клеток РС-3 после воздействия на них комплекса вторичных пептидных метаболитов. Опытным путем установлено, что выживаемость раковых клеток РС-3 (раковые клетки предстательной железы человека) при действии на них вторичных пептидных метаболитов штамма Trichoderma asperellum F-1087 в концентрациях 0,02; 0,04; 0,08 и 0,17 мг/мл составляет 0,1%, 2,5%, 32,0%, 66.0% и соответственно. Принимая во внимание идентичность клеток организма человека по строению и свойствам, можно утверждать, что комплекс вторичных пептидных метаболитов действует на все опухолевые клетки человека. То есть, комплекс вторичных пептидных метаболитов обладает существенной противоопухолевой активностью и может быть использован в медицине, в качестве средства подавляющего активность опухолевых клеток не только предстательной железы человека, но и всех остальных опухолевых клеток человека.

ПРИМЕР 3. Определение фунгицидной активности

Совершая действия по ПРИМЕРУ 1, выделяют комплекс вторичных пептидных метаболитов штамма Trichoderma asperellum F-1087. Фунгицидную (противогрибковую) активность заявляемого штамма определяют известным путем [5]. Противогрибковую активность проверяют против фитопатогенов растений: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, как наиболее распространенных возбудителей заболеваний растений в Поволжском регионе. На чашку Петри, засеянную одним из фитопатогенов, помещают пропитанный комплексом вторичных пептидных метаболитов (штамма) диск фильтровальной бумаги диаметром 7 мм. В течение семи суток инкубации при +28°С определяют фунгицидную активность путем измерения величины диаметра d зоны подавляемости патогенных грибов. По истечении 7 суток роста измеряют, например - линейкой, размер диаметра d зоны подавляемости. При этом общепринято считать, что чем больше, например в диаметре, размер зоны подавляемости роста патогенного гриба, тем фунгицидную активность оказывает фракция вторичных метаболитов. Установлено, что комплекс вторичных пептидных метаболитов (с диаметром d зоны подавления) подавляет рост Aspergillus niger с d=18 мм и Fusarium oxysporum с d=15 мм. То есть выявлено, что выделяемый комплекс вторичных пептидных метаболитов штамма Trichoderma asperellum F-1087 может быть использован также для подавления болезней сельскохозяйственных культур.

ПРИМЕР 4. Определение антибактериальной активности

Совершая действия по ПРИМЕРУ 1, выделяют комплекс вторичных пептидных метаболитов штамма Trichoderma asperellum F-1087.

Антибактериальную активность проверяют с использованием наиболее распространенных патогенных в мире грамм-положительных бактерий, например Bacillus subtilis, Mycobacterium sepedonicum (возбудитель картофельной гнили), Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк-возбудитель многих инфекций и заболеваний, например, инфекции кожи и дыхательных путей), а также грамм-отрицательных бактерий, например Pseudomonas syringae (вызывает у растений бурое слизеточение, обморожения, повреждения плодов и пятнистость листьев).

На чашку Петри, засеянную одним из видов бактерий, например Bacillus subtilis, помещают пропитанный фракцией вторичных метаболитов диск фильтровальной бумаги диаметром 7 мм. Содержимое чашки Петри инкубируют, например в темноте, при температуре +28°С, в течение 48 час. После двух суток инкубации определяют антибактериальную активность вторичных пептидных метаболитов штамма Trichoderma asperellum F-1087.

Активность определяют описанным в ПРИМЕРЕ 3 путем. В качестве контроля используют известное средство - диски фильтровальной бумаги [6], пропитанные широко применяемыми антибиотиками - Амфотерицин В (концентрация - 40 мг/мл) и Ампициллин (концентрация - 10 мг/мл).

По истечении двух суток (через 48 час) роста штамма измеряют, например линейкой, величину зоны (например в виде окружности вокруг пропитанного фракцией вторичных метаболитов штамма диска фильтровальной бумаги диаметром 7 мм) подавляемости бактериальных микроорганизмов. При этом чем размер зоны подавляемости микроорганизма, тем большую антибактериальную активность проявляет фракция вторичных пептидных метаболитов штамма Trichoderma asperellum F-1087. Установлено, что фракция вторичных метаболитов подавляет активность бактерий, например у В. Subtilis величина зоны подавляемости d=12 мм, у Mycobacterium sepedonicum величина зоны подавляемости d=8 мм, у Staphylococcus aureus величина зоны подавляемости d=16 мм.

Сравнение величин зон подавляемости бактериальных микроорганизмов заявляемыми метаболитами и известных антибиотиков показывает, что заявляемый комплекс вторичных пептидных метаболитов штамма Trichoderma asperellum F-1087 в подавлении микроорганизмов не уступает Амфотерицину В с d=10 мм и существенно превосходит Ампициллин с d=12 мм.

Опытами доказано, что выделяемый комплекс вторичных пептидных метаболитов штамма Trichoderma asperellum F-1087 может быть использован для подавления расширенного, по сравнению с прототипом [4], перечня бактериальных болезней сельскохозяйственных культур.

ПРИМЕР 5. Определение ферментативной активности

Совершая действия по ПРИМЕРУ 1, выделяют комплекс вторичных пептидных метаболитов штамма Trichoderma asperellum F-1087.

Подготовливают буферный раствор [7, стр. 81] в концентрации от 10 до 100 ME мл^-1.

Затем стандартный ферментный раствор [7, стр. 81] разбавляют подготовленным буферным раствором до конечной концентрации от 0,20 до 0,70 ME мл^-1 для ксиланазы и β-глюканазы и от 0,15 до 0,25 ME мл^-1 для целлюлазы, получают разбавленный стандартный ферментный раствор (далее по тексту - РСФР).

Подготавливают от 0,2 до 5,0 г образцов (1000-10,000 ME) комплекса вторичных пептидных метаболитов штамма, взвешивают их (образцы) и, помешивая, растворяют в 100 мл РСФР до необходимой концентрации, например от 0,2 до 0,7 ME мл^-1 для ксиланазы и β-глюканазы и от 0,15 до 0,25 ME мл^-1 для целлюлазы. Контроль - H₂O.

Помещают 0,03 мл образца комплекса вторичных пептидных метаболитов штамма или контроля в двухмиллилитровые пробирки Эппендорфа и предварительно инкубируют содержимое пробирок в течение 5 мин при +40°С на водяной бане. Затем в каждую из пробирок Эппендорфа добавляют по 0,3 мл раствора субстрата фермента (РСФР), перемешивают и продолжают инкубацию с погружением пробирок в кипящую водяную баню. Через 20 мин инкубации реакцию прекращают, например путем добавления 0,15 мл стоп-раствора и перемешивания. Содержимое пробирок охлаждают в бане со льдом в течение 5 мин. Добавляют 1,5 мл воды, перемешивают и определяют оптическую плотность раствора ΔOD.

Оптическую плотность раствора (поглощение) ΔOD₅₃₀ измеряют по [7] при длине волны излучения λ=530 нм с использованием двухлучевого спектрофотометра. Удельную активность Уд Акт по отдельным видам фермента Уд Акт считают по формуле

, где

D - коэффициент разбавления, V=100 мл, m - наклон калибровочной кривой (мл ⋅ мкмоль^-1), М - масса образца фермента (г - грамм) и t - продолжительность инкубации (мин).

Опытным путем установлено, что комплекс вторичных пептидных метаболитов штамма Trichoderma asperellum F-1087 имеет ксиланазную Уд Акт = 8,82 МЕ/мл, целлюлазную Уд Акт = от 1,1 до 1,6 МЕ/мл, протеазную Уд Акт = от 0,02 до 0,03 МЕ/мл.

Приведенные примеры применения предлагаемого изобретения показывают его активность к широкому спектру болезнетворных микроорганизмов растений и человека, что доказывает его полезность в биотехнологиях, для разработки перспективных лекарственных средств для лечения людей, для дезинфекции поверхностей в медицине и в области биологической защиты сельскохозяйственных растений от расширенного (по сравнению с прототипом) перечня фитопатогенов.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявляемый штамм и его применение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с существенными признаками заявленного изобретения, и не установлена известность влияния существенных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленном производстве лекарственных средств и биопрепаратов для деятельности организаций здравоохранения, растениеводства посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.

Использованные источники

1. Патент RU 2558293. МПК C12N 1/14 (2006.01), A61K 35/74 (2015.01), C12R 1/885 (2006.01). Приоритет от 22.07.2014. Опубл. 27.07.2015.

2. Патент RU 2475528. МПК C12N 1/14 (2006.01), A01N 63/04 (2006.01), C12R 1/885 (2006.01). Приоритет от 24.03.2011. Опубл. 20.02.2013. Описание патента Штамм Trichoderma harzianum Rifai - продуцент ингибитора вируса кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot virus) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № F-180.

3. Р.И. Тухбатова, А.Н. Фаттахова, Ф.К. Алимова. Противоопухолевые свойства Trichoderma asperellum 302 из погребенных почв.

4. Патент СССР SU 1717052. МПК⁵ A01N 63/04, C12N 11/14. Приоритет от 22.08.1988. Опубл. 07.03.1992. Описание патента. Штамм гриба Trichoderma lignorum ВНИСХМ №37 для производства триходермина. Ж-л «Цитология», 2014. Том 56, №6. - С. 450-452.

5. О.М. Al-Obaidy, М.A. Al-Rijabo, Antagonistic Activity and Production of Antifungal Compound(s) from Selected Trichoderma spp. // J. Edu. & Sci., Vol. (23), No. (3) 2010.

6. V.S. Sadykovaa, A.V. Kurakovb, A.E. Kuvarinab, and E.A. Rogozhin, Antimicrobial Activity of Fungi Strains of Trichoderma from Middle Siberia // ISSN 0003-6838, Applied Biochemistry and Microbiology, 2015, Vol. 51, No. 3, pp. 355-361.

7. J. , R. Grasser, H. Pikor, K. Vogel, Determination of xylanase, β-glucanase, and cellulase activity //Anal Bioanal Chem (2002) 374:80-87.