Сорбенты для выделения из воды и водных растворов неорганических солей эндотоксинов

Изобретение относится к области медицины и биотехнологий и касается способа сорбционной очистки воды и водных растворов от эндотоксинов.

Основными требованиями к инфузионным растворам являются стерильность и апирогенность. Пирогенные реакции или лихорадочные состояния вызываются при попадании в кровяное русло вместе с трансфузионной средой пирогенов, важнейшими из которых являются эндотоксины грамотрицательных бактерий. Эндотоксины представляют собой липополисахариды (ЛПС), являющиеся основным компонентом внешнего слоя наружной мембраны грамотрицательных бактерий. При разрушении бактериальных клеток ЛПС выделяются в окружающую среду, формируя в водной среде агрегатные формы. Предельно допустимое содержание бактериальных эндотоксинов в воде для инъекций, установленное Фармакопеями многих стран, в том числе РФ, составляет 0,25 единиц эндотоксина в мл (0,25 EU/мл). В питьевой воде, для сравнения, содержится более 2 EU/мл эндотоксинов. При приготовлении инфузионных растворов вода является основным источником эндотоксинов, поэтому разработка способов удаления эндотоксинов из воды является актуальной задачей биотехнологии и медицины. Использование больших объемов плазмозамещающих растворов создает условия для попадания в организм больного значительных количеств эндотоксинов, способных вызвать пирогенную реакцию. В этой связи возникает необходимость очистки солевых растворов, изотоничных плазме крови, от эндотоксинов.

В структуре молекул ЛПС принято выделять 3 части: липид А, кор и О-антигенную цепь. Химически липид А представляет собой ацилированный дисахарид глюкозамина, а кор и О-антиген - олигосахариды. ЛПС несут значительный отрицательный заряд, обусловленный наличием фосфатных и карбоксильных групп, которые сосредоточены преимущественно в коровой части молекулы. Наличие отрицательно заряженных групп обусловливает электростатическое связывание ЛПС с соединениями, несущими положительно заряженные центры.

Известен сорбент, представляющий собой мембрану, полученную на основе хитозана, через которую пропускают очищаемый от эндотоксинов раствор под дифференциальным давлением [JP 4040234, 10.02.1992]. Недостатком сорбента является сложный способ наслаивания хитозана при изготовлении сорбционных мембран, а также необходимость применения дифференциального давления, которое необходимо строго контролировать.

Известен гелеобразный сорбент эндотоксинов, получаемый путем сополимеризации этиленгликоля диметакрилата и глицидилметакрилата в присутствии катализатора и порообразующего агента под дифференциальным давлением [JP 5032539, 09.02.1993]. Недостатком гелеобразного сорбента является возможное изменение его пористой структуры при воздействии давления и ухудшение сорбционных свойств.

Известен также сорбент для очистки воды и водных растворов от эндотоксинов на основе частиц целлюлозы с диаметром 20-2000 мкм и диаметром пор 2-30 мкм с нанесенным хитозаном [JP 7000816, 06.02.1992]. Недостатком указанного сорбента является широкое варьирование размеров частиц и диаметра пор носителя, что затрудняет стандартизацию получения и применения сорбента.

Известен сорбент для очистки водных растворов от эндотоксинов, представляющий собой цеолит, модифицированный хитозаном, или цеолит, модифицированный хитозаном и обработанный раствором сульфата меди с последующим добавлением раствора железистосинеродистого калия [РФ №2529221]. Недостатком сорбентов является заявленная возможность их использования для удаления эндотоксинов только из растворов, приготовленных на дистиллированной воде, тогда как инфузионные растворы содержат до 150 мМ хлорида натрия.

Известны и другие сорбенты эндотоксинов: содержащие полимиксин (Talmadge et al., J. Chromatogn, 1989, p. 175, Vol. 476; Anspach et al., J. Chromatogr. A., 1995, p. 81, Vol. 711) и другие аффинные лиганды. Недостатком полимиксина является токсичность данного соединения, что ограничивает его применение для очистки инфузионных препаратов от эндотоксинов.

Разработан афинный сорбент эндотоксинов из водных растворов, содержащий лиганд поли(1-винилимидазол), привитый на винил силан-модифицированный пористый силикагель с размером пор 40 нм и диаметром частиц 50 мкм [Li et al., Process Biochemistry 46 (2011) 1462-1468]. Достоинствами данного сорбента являются стабильные показатели удаления эндотоксинов из водных растворов с различными рН и ионной силой (концентрацией хлорида натрия). Недостатком удаления эндотоксинов с помощью данного сорбента является длительное (3 ч) время инкубации сорбента с раствором эндотоксина. Кроме того, данный сорбент нейтрален, он приобретает положительный заряд и афинность при рН менее 6-7, вследствие чего при рН более 7 его эффективность падает.

Эффективными в очистке воды и водных растворов неорганических солей от эндотоксинов могут быть и другие сорбенты на основе силикагеля, содержащего специфические аффинные лиганды.

Задачей изобретения является расширение ассортимента сорбентов для очистки воды и водных растворов неорганических солей от эндотоксинов.

Задача решается тем, что в качестве сорбентов для очистки воды и водных растворов неорганических солей от эндотоксинов применяют сорбенты, представляющие собой иммобилизованный на силикагеле поликатионный металлофталоцианин, содержащий кватернизованные аминогруппы, формулы ZnPcChol_n, (Chol=CH₂N⁺(СН₃)₂С₂Н₄ОН, n=7, 8).

Предлагаемые в качестве сорбентов для эндотоксинов силикагели с иммобилизованным поликатионным металлофталоцианином были известны в качестве препаратов для фотообеззараживания бактерий в водных средах [Патенты РФ №2447027 и №2538261]. Оказалось, что они эффективны и в очистке воды от эндотоксинов. Возможно, что это связано с наличием в структуре предлагаемого аффинного сорбента положительно заряженных групп, обеспечивающих электростатическое связывание отрицательно заряженных ЛПС.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют предлагаемое изобретение.

Пример 1.

Для обнаружения эндотоксинов грамотрицательных бактерий в растворе использовался ЛАЛ-тест. В основе ЛАЛ-теста лежит способность лизата амебоцитов (форменных элементов гемолимфы) мечехвоста специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий, что приводит к образованию агрегатов, адгезии и дегрануляции амебоцитов. В результате этого взаимодействия происходит помутнение реакционной смеси, образование плотного геля, что является индикатором присутствия эндотоксина. Для определения наличия эндотоксинов использовался набор реактивов PyrosateΘ. ЛАЛ-тест проводился в двух параллельных повторностях. Для обнаружения эндотоксинов грамотрицательных бактерий после их инкубации с сорбентом смешивали водные растворы ЛПС с реактивом ЛАЛ-теста. Инкубацию проводили при 37°С в течение 21 минуты. После инкубации пробирки плавно переворачивали на 180 градусов. В случае отсутствия геля в пробирке с исследуемым образцом (отрицательный результат) считали, что содержание эндотоксина в исследуемом образце (SPL) меньше 0,25 ЕдЭ/мл (заявленный производителем показатель). Подтверждением достоверности теста являлось образование геля в пробирке с положительным контролем (РРС).

Проводят инкубацию при 37°С в течение часа 200 мг диасорб-250-амин с привитым ZnPcChol₇ (5 μМ/г, получен по патенту РФ №2447027) с 2 мл водного раствора эндотоксина (липополисахарида) Escherichia coli O111:В4 (10^-8-10^-10 М). После осаждения сорбента надосадочную жидкость проверяют на наличие эндотоксина с помощью ЛАЛ-теста с пороговой чувствительностью 0,25 единиц эндотоксина/мл, используя набор реактивов Pyrosate®. При исходной концентрации эндотоксина 10^-10-10^-9 М результат ЛАЛ-теста - отрицательный (Таблица 1), то есть концентрация эндотоксина после инкубации с сорбентом менее 10^-11 М или 0,25 ЕдЭ/мл.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что концентрация привитого ZnPcChol₇ составляет 10 μМ/г. При исходной концентрации эндотоксина 10^-10-10^-9 М результат ЛАЛ-теста - отрицательный (Таблица 1), то есть концентрация эндотоксина после инкубации с сорбентом менее 0,25 ЕдЭ/мл.

Пример 3. Отличается от примера 1 тем, что активная фаза ZnPcChol₈ иммобилизована на силохром С-120 путем равновесной адсорбции. При исходной концентрации эндотоксина 10^-10-10^-9 М результат ЛАЛ-теста - отрицательный (Таблица 1), то есть концентрация эндотоксина после инкубации с сорбентом менее 0,25 ЕдЭ/мл.

Пример 4.

Отличается от примера 1 тем, что инкубацию сорбента проводят с 2 мл раствора эндотоксина в солесодержащем растворе (140 мМ NaCl). При исходной концентрации эндотоксина 10^-10-10^-9 М результат ЛАЛ-теста - отрицательный, то есть концентрация эндотоксина после инкубации с сорбентом менее 0,25 ЕдЭ/мл.

Пример 5.

Отличается от примера 4 тем, что в растворе эндотоксина содержатся 140 мМ NaCl и 4 мМ CaCl₂. При исходной концентрации эндотоксина 10^-10-10^-9 М результат ЛАЛ-теста - отрицательный, то есть концентрация эндотоксина после инкубации с сорбентом менее 0,25 ЕдЭ/мл.

Пример 6.

Отличается от примера 5 тем, что активная фаза ZnPcChol₇ иммобилизована путем адсорбции на силохром С-120. При исходной концентрации эндотоксина 10^-10 М результат ЛАЛ-теста - отрицательный, то есть концентрация эндотоксина после инкубации с сорбентом менее 0,25 ЕдЭ/мл.

Таким образом, предлагаемые сорбенты, представляющие собой иммобилизованный на силикагеле поликатионный металлофталоцианин, являются эффективными в очистке как воды, так и водных растворов неорганических солей от эндотоксинов.