СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ВЫЖИВАЕМОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ БЫКОВ ПРИ КРИОКОНСЕРВАЦИИ

Относится к сельскохозяйственному производству, в частности к воспроизводству крупного рогатого скота, и может использоваться при искусственном осеменении коров криоконсервированной спермой, а также для создания криобанков спермы быков.

В настоящее время для криоконсервации сперматозоидов чаще всего используется следующая методика. Сперму смешивают с разбавителем в отношении 1:1 при 27°С, охлаждают до 18-22°С, производят окончательное разбавление, фасовку и эквилибрацию (выдержка при 4°С в течение 3-4 часов). Потом проводят программное охлаждение в течение 7,5 минут до температуры -145°С и для длительного хранения контейнер с образцами помещают в жидкий азот, имеющий температуру -196°С [1]. Описанный способ и был выбран в качестве прототипа.

Все разбавители спермы содержат криопротекторы, предназначенные для защиты сперматозоидов от разрушения при замораживании, обеспечивая максимально возможное выживание после оттаивания. Однако практика показывает, что какие бы криопротекторы ни применялись, выживает примерно половина.

Задачей настоящего изобретения была разработка способа замораживания спермы быков, позволяющая существенно поднять выживаемость при криоконсервации.

В результате многочисленных экспериментов было обнаружено, что значительному увеличению выживаемости спермы способствует ее капацитация перед замораживанием. Суть предлагаемого способа состоит в следующем. Сперматозоиды быков помещают в среду, содержащую индукторы капацитации, такие как гепарин, теофиллин, дбцАМФ, где выдерживают в течение 4 часов при 38,5°С, затем охлаждают до 18-22°С, производят окончательное разбавление и фасовку, потом выдерживают при 4°С в течение 3-4 часов, охлаждают в течение 7,5 минут до -145°С и помещают в жидкий азот.

Эксперименты проводили во Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных. Сперму быков Голштинской породы получали на племенном предприятии «Невское», где впоследствии проводилась криоконсервация.

Сперматозоиды отмывали от семенной плазмы двухкратным центрифугированием при 300 g в течение 10 мин в среде Sp-TALP, состоящей из: 100 мМ NaCl, 3.1 мМ KCl, 25 мМ NaHCO₃, 0.3 мМ NaH₂PO₄, 21.6 мМ Lactate (sodium salt), 0.5 мМ CaCl₂, 0.4 мМ MgCl₂, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата и 0,1% поливинилалкоголя.

Капацитацию спермиев проводили в течение 4 часов при 38,5°С в такой же среде, где вместо поливинилалкоголя брали BSA в концентрации 6 мг/мл. В качестве индукторов капацитации применяли гепарин и пару соединений теофиллин/дбцАМФ. Подготовка к криоконсервации проводилась по методике, описанной выше.

В опытах участвовали девять быков, имеющих разные показатели продуктивности. Сперму каждого быка разделяли на три части. Первую готовили к замораживанию по обычной методике, вторую - по заявленному способу с использованием гепарина в качестве индуктора капацитации, третью - с применением пары теофиллин/дбцАМФ. Результаты первой группы попадали в контроль, второй - вариант 1, третьей - вариант 2.

Для исследования эффекта заявленного способа после криоконсервации образцы размораживали на водяной бане при 38,5°С в течение 10-12 секунд. Затем сперматозоиды отмывали от криопротектора двухкратным центрифугированием со средой Sp-TALP.

Соотношение погибших и выживших клеток определяли по стандартной методике путем окрашивания 0,06% раствором PropidiumIodid и подсчетом под микроскопом. Сперматозоиды, показывающие яркую флуоресценцию по всей головке, оценивались как мертвые, со слабо окрашенной головкой - как живые.

Общие усредненные показатели по выжившим сперматозоидам получились такими: контроль - 54%, вариант 1 - 73%, вариант 2 - 71%. Среднестатистическая погрешность не превысила 1%.

Технический результат изобретения состоит в резком увеличении выживаемости спермы быков при криоконсервации.

Источники информации

1. В.И. Фисинин и др. Национальная технология замораживания и использования спермы племенных быков-производителей// Москва, 2008, с. 64-74.