Результат интеллектуальной деятельности: Штамм базидиомицета Fomitopsis pinicola ВКПМ F-1285 - продуцент липидов

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма базидиомицета Fomitopsis pinicola, продуцирующего липиды. Липиды, полученные микробиологическим путем, могут быть использованы в качестве сырья для получения биодизельного топлива, в медицине, фармацевтике и в парфюмерно-косметической, пищевой и химической отраслях промышленности.

Уровень техники

Из уровня техники известны штаммы базидиомицетов Ganoderma tsugae var. jannieae Tay-1 [WO 2009017462 A2, 2007] и Pleurotus ostreatus CBS 101937 [US 6372964 B1, 2002], содержащие в составе мицелия до 10,2 и 7,2% липидов от сухого веса грибов соответственно. Недостатком указанных штаммов является низкое содержание липидной фракции.

Наиболее близким к заявленному штамму является штамм Laetiporus sulphureus LS 1-06, способный накапливать в составе мицелия до 8,4% липидов от сухого веса грибов. Недостатком указанного штамма являются низкая скорость роста и низкое содержание липидной фракции [Уфимцева О.В., Миронов П.В. Получение биомассы мицелия грибов вешенки обыкновенной Р 05/88 Pleurotus ostreatus и серно-желтого трутовика LS 1-06 Laetiporus sulphureus в глубинных условиях //Хвойные бореальной зоны. - 2009. - Т. 26. -№. 2. - С. 294-296].

Раскрытие изобретения

Целью изобретения является получение нового штамма базидиомицета Fomitopsis pinicola, продуцирующего липиды в условиях погруженного культивирования, с высоким содержанием липидной фракции.

Поставленная цель достигается тем, что выделен новый штамм Fomitopsis pinicola (F. pinicola), задепонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ F-1285.

Новый штамм выделен из природного плодового тела, найденного на мертвой древесине Betula pendula. Кусочки гриба, вырезанные из середины плодового тела, в асептических условиях были перенесены на селективную плотную питательную среду (сусловый агар), содержащую 30 мг/л ампициллина и 4 мг/л беномила. Выросший мицелий был идентифицирован как чистая базидиальная культура по наличию пряжек на мицелии. Таксономическая принадлежность заявляемого штамма к виду Fomitopsis pinicola подтверждена молекулярно-генетическим методом. Штамм базидиального гриба F. pinicola депонирован.

Характеристики штамма Fomitopsis pinicola

Выделенный штамм относится к классу Basidiomicetes, подклассу Agaricomycetidae, порядку Polyporales, семейству Fomitopsidaceae, роду Fomitopsis, виду pinicola.

Вид F. pinicola не патогенен для человека и не образует токсичные метаболиты ни на одной из стадий морфогенеза.

Условия культивирования: сусловый агар, температура +28°С.

Условия хранения: в пробирках с сусловым агаром при +4°С в течение 12-18 месяцев без пересева.

Макроморфологические признаки: на сусловом агаре колония округлая с ризоидным краем, пушится вокруг инокулюма, профиль приподнятый. Воздушный мицелий белого цвета, субстратный мицелий бесцветный, обратная сторона колонии не окрашена. Структура колонии ватно-пушистая, слабошероховатая, плотная. По мере старения мицелий становится плотным.

Гифы воздушного мицелия до 4 мкм в диаметре, разветвленные, короткие. На мицелии имеются округлые медальонные пряжки стабильной формы.

Вегетативный мицелий базидиомицета выращивают в погруженной культуре в асептических аэробных условиях.

Культивирование осуществляют в качалочных колбах объемом 750 мл на орбитальной качалке при температуре 28°С.

Среда для погруженного культивирования содержит: глюкозу - 10-30 г/л, соевую муку - 5-15 г/л, дигидрофосфат калия - 2-3 г/л, сульфат магния - 0,2-0,3 г/л и водопроводную воду. Значение рН среды доводят до 5,5-6,2. Питательную среду автоклавируют при температуре 121°С в течение 30 минут. Длительность процесса получения жидкого посевного мицелия составляет 4 суток, ферментации - 6 суток.

Биомассу отделяют от культуральной жидкости фильтрованием через лавсановую ткань. Липиды выделяют из влажной биомассы (влагосодержание 80-85%) по методу Фолча [Folch J. et al. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J biol chem. - 1957. - Vol. 226. - №. 1. - pp.497-509].

Максимальный выход липидной фракции составляет 21,3% от веса воздушно высушенной биомассы через 6 суток культивирования при температуре 28°С.

Осуществление изобретения

Сведения, подтверждающие возможность осуществления предлагаемого изобретения

Пример 1. Получение погруженного мицелия F. pinicola

Погруженное культивирование штамма F. pinicola проводили на орбитальном шейкере со скоростью вращения 250 об/мин при температуре 28°С в качалочных колбах объемом 750 мл, содержащих 100 мл питательной среды следующего состава: глюкоза - 20 г/л, соевая мука - 10 г/л, дигидрофосфат калия - 2,5 г/л и сульфат магния - 0,25 г/л. Уровень рН среды доводят до 5,5-6,2. Процесс погруженного культивирования проводили в два этапа. На первом этапе получали жидкий посевной материал, на втором этапе осуществляли ферментацию.

Для приготовления посевного материала использовали культуру, выращенную в пробирках на сусловом агаре. Кусочки агара размером не более 3×3 мм в количестве 30-40 штук асептически вносили в качалочные колбы, содержащие 100 мл питательной среды, и культивировали в течение 4 суток. Затем 10 мл посевного материала в асептических условиях вносили в качалочные колбы, содержащие 100 мл питательной среды, и культивировали в течение 6 суток. Выход воздушно высушенной биомассы составлял 6,7 г/л питательной среды на 6 сутки ферментации. Содержание суммарных липидов в погруженном мицелии, определенное весовым методом, составляло 21,3% от веса воздушно высушенной биомассы.

Пример 2. Получение погруженного мицелия F.pinicola

Получение погруженного мицелия F. pinicola проводили, как описано в примере 1, но глюкозу, соевую муку, дигидрофосфат калия и сульфат магния в питательную среду вносили в количестве 10 г/л, 5 г/л, 3 г/л и 0,3 г/л соответственно. Выход воздушно высушенной биомассы составлял 4,9 г/л питательной среды на 6 сутки ферментации. Содержание суммарных липидов в погруженном мицелии, определенное весовым методом, составляло 19,3% от веса воздушно высушенной биомассы.

Пример 3. Получение погруженного мицелия F. pinicola

Получение погруженного мицелия F. pinicola проводили, как описано в примере 1, но глюкозу, соевую муку, дигидрофосфат калия и сульфат магния в питательную среду вносили в количестве 30 г/л, 15 г/л, 2 г/л и 0,2 г/л соответственно. Выход воздушно высушенной биомассы составлял 5,2 г/л питательной среды на 6 сутки ферментации. Содержание суммарных липидов в погруженном мицелии, определенное весовым методом, составляло 19,7% от веса воздушно высушенной биомассы.

Пример 4. Получение липидов F. pinicola

Получали погруженную культуру F. pinicola, как описано в примере 1. Биомассу отделяли от культуральной жидкости фильтрованием через лавсановую ткань и однократно промывали дистиллированной водой. Навеску влажной биомассы (влагосодержание 80-85%) растирали с песком в жидком азоте до пастообразного состояния и экстрагировали смесью хлороформа и метанола (1:1 по объему). Экстракт фильтровали через бумажный фильтр, твердый остаток подвергали повторной экстракции. К объединенному фильтрату добавляли дистиллированную воду. Водно-метанольную и хлороформную фазы разделяли в делительной воронке. Хлороформный слой, содержащий липиды, сушили над слоем безводного сульфата натрия, растворитель упаривали на вакуумном ротационном испарителе.

Пример 5. Динамика накопления липидов штаммом F. pinicola

Получали погруженную культуру F. pinicola, как описано в примере 1. Отбор проб для определения содержания липидов в мицелии проводили каждые 24 часа. Липиды из биомассы выделяли, как описано в примере 5. Максимальный выход липидной фракции составлял 21,3% от веса воздушно высушенной биомассы на 6 сутки культивирования (таблица 1).

Жирнокислотный состав липидов, выделенных из F. pinicola, определяли методом газовой хроматографии. В составе липидной фракции преобладают линолевая, олеиновая и пальмитиновая кислоты (таблица 2).