Результат интеллектуальной деятельности: Губка гемостатическая и способ ее получения

Изобретение относится к медицине, а именно к созданию новых гемостатических средств, и может быть использовано для остановки кровотечений в хирургической практике, в условиях боевых действиях, при ликвидации последствий массовых катастроф и террористических актов, а также в условиях боевых действий.

Развитие военной науки и техники неизбежно сопровождается появлением новых видов поражений, усилением тяжести патологического процесса, в том числе геморрагических осложнений при огнестрельных ранениях, воздействиях ядерного и химического оружия. В этих условиях особую роль играет разработка гемостатических средств для оказания помощи при критических и неотложных состояниях в условиях боевых действий и в медицине катастроф. Профилактика и остановка кровотечений имеют также важнейшее значение в различных областях клинической медицины, в гематологии, хирургии, травматологии, онкологии, акушерстве и других в связи с внедрением в медицинскую практику новых антикоагулянтов, не имеющих антидотов, а также лекарств, обладающих, наряду с терапевтическими эффектами, гепатотоксическим действием. С учетом изложенного создание нового гемостатического агента, не повышающего тромбогенный потенциал крови, но оказывающего профилактическое и лечебное кровоостанавливающее действие на фоне травмы и приема антитромботических препаратов, представляется крайне важным.

На сегодняшний день известны сведения об использовании в хирургии различных клеевых субстанций с такими гемостатическими компонентами, как фибриноген, тромбин и некоторые другие факторы свертывания крови (Перельман М.И. и др. Современные клеевые композиции в торакальной хирургии // Хирургия. - 2002. - №2. - с. 47-49). Фибриновые клеи, например «Берипласт (TM)», состоят из 3-4 компонентов и должны быть нанесены на раневую поверхность последовательно в несколько этапов, что создает определенные неудобства при лапароскопических операциях. Непосредственное же смешивание компонентов перед применением неизбежно приводит к образованию сгустка фибрина, потере клеящих свойств и закупорке просвета лапароскопа.

Известна гемостатическая губка, содержащая матрицу из биоматериала и один гидрофильный полимерный компонент, содержащий электрофильные реакционно-способные группы, и указанный гидрофильный компонент является гидрофильным кросс-сшивателем, при этом они связываются друг с другом так, что реакционная способность полимерного компонента сохраняется, при этом «связанный» означает, что указанный полимерный компонент наносится на поверхность указанной матрицы из биоматериала, или указанная матрица пропитывается указанным полимерным материалом, или и то и другое, причем указанный биоматериал выбирают из группы, состоящей из коллагена, желатина, фибрина, полисахарида, такого как хитозан, синтетического биодеградируемого биоматериала, такого как полимолочная кислота или полигликолиевая кислота, и их производных (RU 2562569, 10.09.2015). Губка демонстрирует низкое набухание после применения на ране. Однако, несмотря на то, что губку получают высушиванием на воздухе или лиофилизацией в сухой форме, тем не менее, содержание воды в ней составляет по меньшей мере 0,5%. А гемостатические свойства свертывание крови в течение 2 минут показаны на образце губки, содержащей в качестве основы только коллаген.

Наиболее близкой и потому взятой за ближайший аналог является гемостатическая губка, представляющая собой высушенный сублимационной сушкой 1% раствор коллагена в карбонате аммония с pH 8,5-8,9, который содержит феракрил, при следующих соотношениях компонентов, %: коллаген 98,0-99,2, феракрил - 0,8-2,0. При этом губка может быть дополнительно структурирована в парах альдегидов и может дополнительно содержать до 3% антисептиков и 10% антибиотиков широкого спектра действия. При этом она обладает высокой гемостатической активностью (RU 2385726, 10.04.2010). Недостатком указанной гемостатической губки является ее адгезивность к перчаткам и другим хирургическим инструментам.

Сущность изобретения

Технический результат заявленной гемостатической губки и способа ее получения заключается в расширении ассортимента гемостатических губок на основе хитозана и фибрин-мономера с выраженным гемостатическим действием.

Технический результат достигается тем, что создана гемостатическая губка, содержащая основу и активное вещество, высушенные сублимационной сушкой, при этом она в качестве основы содержит хитозан в уксусной кислоте, а в качестве активного вещества фибрин-мономер, при следующем соотношении компонентов в конечном водном растворе в объеме 1 литр в %:

В предпочтительном варианте гемостатическая губка дополнительно содержит в конечном водном растворе в объеме 1 литр в %: эпсилон-аминокапроновую кислоту - 0,5-10; тромбин - 0,0001-0,03 (от 1 ед. NIH до 9000 ед. NIH).

А также разработан способ получения гемостатической губки, включающий высушивание сублимационной сушкой смеси растворов веществ, при этом хитозан и уксусную кислоту вносят в дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов в конечной концентрации: хитозана от 0,1% до 8%, уксусной кислоты от 0,1% до 5%, растворяют хитозан при перемешивании и добавляют фибрин-мономер в количестве от 0,01% до 0,5%, полученную смесь перемешивают до однородной массы и подвергают сублимационной сушке.

В предпочтительном варианте дополнительно к смеси добавляют от 0,5% до 10% эпсилон-аминокапроновой кислоты и от 0,0001% до 0,033% тромбина по отношению к хитозану.

С целью придания губке антисептического и антибактериального эффектов в базовый раствор могут быть добавлены антисептики (до 3%) и антибиотики широкого спектра действия (до 10%) от общей массы смеси.

Фибриноген - крупная молекула, которая состоит из трех пар полипептидных цепей, объединенных в три домена. Тромбин гидролизует Арг-Гли связи так, что от каждой молекулы фибриногена отщепляется два пептида А и два пептида В. Образуется фибрин-мономер, который имеет тенденцию к спонтанной полимеризации в мультимолекулярные агрегаты. Фибрин-мономеры, приложенные к раневой поверхности, образуют первичные димеры - протофибриллы, мономеры в которой соединены конец к середине. Далее происходит самосборка протофибрилл, образование пучков волокон и стабилизация с помощью изопептидных связей между остатками глутаминовой кислоты и лизина. Такой стабилизированный фибрин и является структурной основой кровяного сгустка.

Эпсилон аминокапроновая кислота - ингибитор фибринолиза. Ингибирует активаторы профибринолизина и тормозит его превращение в фибринолизин. Тормозит активирующее действие стрептокиназы, урокиназы и тканевых киназ на фибринолиз. Также ε аминокапроновая кислота стимулирует образование тромбоцитов, сенсибилизирует тромбоцитарные рецепторы к тромбину, тромбоксану А2 и другим эндогенным агрегантам.

Активатор фибриногена - тромбин - принадлежит к семейству сериновых протеиназ и запускает каскад биохимических реакций системы свертывания крови. Кроме превращения фибриногена в фибрин, он является также мощным активатором агрегации и адгезии тромбоцитов. При действии тромбина на тромбоциты уже через 5 секунд после стимуляции происходит изменение формы клетки, централизация гранул, секреция их содержимого в систему открытых каналов и далее во внеклеточную среду. Вследствие мощного действия и опасности тромбоза тромбин применяется только местно.

Хитозан представляет собой высокомолекулярный полимер глюкозамина, растворимый в разбавленных органических кислотах. Механизм гемостатического действия хитозана связан со способностью положительно заряженных молекул соединяться с отрицательно заряженными мембранами красных кровяных телец и образовывать тромб.

Фибрин-мономер получают по способу, описанному в патенте RU №2522237. Для этого берут 30 л свежезамороженной плазмы человека и размораживают при температуре +37°C, при постоянном перемешивании добавляют в плазму 10 л насыщенного раствора сульфата аммония и полученную смесь выдерживают 15 минут при комнатной температуре, после чего центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость сливают, затем в 7 л 0,05 М фосфатного буфера растворяют 1,4 кг мочевины и подогревают до температуры +37°C, далее в этом буфере растворяют полученный ранее осадок фибриногена, затем добавляют сюда же 50000 ед. тромбина человека, перемешивают и оставляют смесь на 1 час при комнатной температуре, после чего разделяют полученную смесь на три части, в емкость с одной из трех частей исходного раствора фибриногена вносят 40 л 0,05 М фосфатного буфера с температурой +37°C, образовавшийся в емкости фибриновый сгусток собирают, промывают в дистиллированной воде и отжимают, в результате получают три отмытых фибриновых сгустка, далее отмыв фибринового сгустка повторяют таким же образом еще два раза, конечный продукт - фибрин-мономер - получают путем растворения отмытого фибринового сгустка в ацетатном буфере с мочевиной, полученный фибрин-мономер разливают во флаконы из расчета 10-20 мг/флакон, далее флаконы с фибрин-мономером замораживают и лиофильно высушивают.

В эксперименте было показано, что губка из хитозана, фибрин-мономера и с дополнительным введением эпсилон аминокапроновой кислоты и тромбина обладает способностью длительно снижать время остановки кровотечения и объем кровопотери.

Примеры

Пример 1

Получение губки с содержанием хитозана и фибрин-мономера. В 500 мл дистиллированной воды добавляют 1,0 г хитозана, 1,0 г уксусной кислоты, растворяют при перемешивании на шейкере в течение 60 минут, затем готовят раствор из 500 мл дистиллированной воды и 0,1 г фибрин-мономера. Полученные растворы смешивают и перемешивают до получения однородной массы, затем разливают в лотки слоем толщиной от 2 до 10 мм, которые помещают в камеру сублимационной сушки при t до -50°C на 48 часов до образования губки.

Соотношение компонентов в 1 литре конечного раствора: уксусная кислота - 0,1%, хитозан - 0,1%, фибрин-мономер - 0,01%.

Пример 2

Получение губки с содержанием хитозана и фибрин-мономера. В 500 мл дистиллированной воды добавляют 20,0 г уксусной кислоты и 30,0 г хитозана, растворяют при перемешивании на шейкере в течение 60 минут, затем готовят раствор из 500 мл дистиллированной воды и 2,5 г фибрин-мономера. Полученные растворы смешивают и перемешивают до получения однородной массы, затем разливают в лотки слоем толщиной от 2 до 10 мм, которые помещают в камеру сублимационной сушки при t до -50°C на 48 часов до образования губки.

Соотношение компонентов в 1 литре конечного раствора: уксусная кислота - 2,0%, хитозан - 3,0%, фибрин-мономер - 0,25%.

Пример 3

Получение губки с содержанием хитозана и фибрин-мономера. В 500 мл дистиллированной воды добавляют 50,0 г уксусной кислоты и 80,0 г хитозана, растворяют при перемешивании на шейкере в течение 60 минут, затем готовят раствор из 500 мл дистиллированной воды и 5,0 г фибрин-мономера. Полученные растворы смешивают и перемешивают до получения однородной массы, затем разливают в лотки слоем толщиной от 2 до 10 мм, которые помещают в камеру сублимационной сушки при t до -50°C на 48 часов до образования губки.

Соотношение компонентов в 1 литре конечного раствора: уксусная кислота - 5,0%, хитозан - 8,0% фибрин-мономер - 0,5%.

Пример 4

Получение губки с содержанием хитозана, фибрин-мономера, ε аминокапроновой кислоты и тромбина. В 500 мл дистиллированной воды добавляют 1,0 г хитозана, 1,0 г уксусной кислоты, растворяют при перемешивании на шейкере в течение 60 минут, затем готовят раствор из 500,0 мл дистиллированной воды и 0,1 г фибрин-мономера. Полученные растворы смешивают, затем добавляют 5 г ε аминокапроновой кислоты и 0,001 г тромбина с активностью 30 ед. NIH, перемешивают до получения однородной массы, затем разливают в лотки слоем толщиной от 2 до 10 мм, которые помещают в камеру сублимационной сушки при t до -50°C на 48 часов до образования губки.

Соотношение компонентов в 1 литре конечного раствора: уксусная кислота 0,1%, хитозан - 0,1%, фибрин-мономер - 0,01%, ε аминокапроновая кислота - 0,5%, тромбин - 0,0001%.

Пример 5

Получение губки с содержанием хитозана, фибрин-мономера, ε аминокапроновой кислоты и тромбина. В 500 мл дистиллированной воды добавляют 20,0 г уксусной кислоты и 30,0 г хитозана, растворяют при перемешивании на шейкере в течение 60 минут, затем готовят раствор из 500,0 мл дистиллированной воды и 2,5 г фибрин-мономера. Полученные растворы смешивают, затем добавляют 50 г ε аминокапроновой кислоты и 0,15 г тромбина с активностью 4500 ед. NIH, перемешивают до получения однородной массы, затем разливают в лотки слоем толщиной от 2 до 10 мм, которые помещают в камеру сублимационной сушки при t до -50°C на 48 часов до образования губки.

Соотношение компонентов в 1 литре конечного раствора: уксусная кислота - 2,0%, хитозан - 3,0%, фибрин-мономер - 0,25%, ε аминокапроновая кислота - 5,0%, тромбин - 0,015%.

Пример 6

Получение губки с содержанием хитозана, фибрин-мономера, ε аминокапроновой кислоты и тромбина. В 500 мл дистиллированной воды добавляют 50,0 г уксусной кислоты и 80,0 г хитозана, растворяют при перемешивании на шейкере в течение 60 минут, затем готовят раствор из 500,0 мл дистиллированной воды и 50,0 г фибрин-мономера. Полученные растворы смешивают, затем добавляют 100 г ε аминокапроновой кислоты и 0,30 г тромбина с активностью 9000 ед. NIH, перемешивают до получения однородной массы, затем разливают в лотки слоем толщиной от 2 до 10 мм, которые помещают в камеру сублимационной сушки при t до -50°C на 48 часов до образования губки.

Соотношение компонентов в 1 литре конечного раствора: уксусная кислота - 5,0%, хитозан - 8,0% фибрин-мономер - 0,5%, ε аминокапроновая кислота - 10,0%, тромбин - 0,03%.

Пример 7

Изучение влияния гемостатической губки на остановку кровотечения проводили в лабораторных условиях на кроликах породы «Шиншилла» обоего пола массой 3,0-4,5 кг со средним значением темпа кровотечения 1 г/мин согласно методике, описанной в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств». Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. Эксперимент выполнялся с введением животного в состояние тиопенталового наркоза. Затем выполнялась тотальная срединная лапаротомия, в образовавшуюся рану выводилась передняя поверхность печени. При помощи пластмассового ограничителя производилась резекция лезвием выступившей части печени. В результате образовывалась равномерно кровоточащая рана. В каждом опыте размер и форма срезанного сегмента оставались неизменными. Для сравнительной оценки гемостатических свойств исследуемого образца и контроля (размером 2×2 см) на доле печени одновременно производились два вышеописанных среза. В качестве контроля использовался марлевый тампон.

Пример 8

Остановка капиллярно-паренхиматозного кровотечения выполнялась путем нанесения на рану губки, полученной по примеру 1. Губка хорошо адгезирует к ране, но быстро растворяется в потоке крови и смывается кровотоком с раневой поверхности. Время остановки кровотечения составляло 394±32 с. В качестве контроля использовали остановку кровотечения путем плотного прижатия к раневой поверхности тампона из марлевой салфетки. Остановка кровотечения происходила в контроле за 408±28 с.

Пример 9

Остановка капиллярно-паренхиматозного кровотечения выполнялась путем нанесения на рану губки, полученной по примеру 2. Губка хорошо адгезирует к ране, обладает высокой гигроскопичностью и полностью останавливает кровотечение за 90±13 с. В качестве контроля использовали остановку кровотечения путем плотного прижатия к раневой поверхности тампона из марлевой салфетки. Остановка кровотечения происходила в контроле за 408±28 с.

Пример 10

Остановка капиллярно-паренхиматозного кровотечения выполнялась путем нанесения на рану губки, полученной по примеру 3. Губка хорошо адгезирует к ране, обладает высокой гигроскопичностью и полностью останавливает кровотечение за 104±16 с. В качестве контроля использовали остановку кровотечения путем плотного прижатия к раневой поверхности тампона из марлевой салфетки. Остановка кровотечения происходила в контроле за 408±28 с.

Пример 11

Остановка капиллярно-паренхиматозного кровотечения выполнялась путем нанесения на рану губки, полученной по примеру 4. Губка хорошо адгезирует к ране, но быстро растворяется в потоке крови и смывается кровотоком с раневой поверхности. Время остановки кровотечения составляло 258±22 с. В качестве контроля использовали остановку кровотечения путем плотного прижатия к раневой поверхности тампона из марлевой салфетки. Остановка кровотечения происходила в контроле за 362±25 с.

Пример 12

Остановка капиллярно-паренхиматозного кровотечения выполнялась путем нанесения на рану губки, полученной по примеру 5. Губка хорошо адгезирует к ране, обладает высокой гигроскопичностью и полностью останавливает кровотечение за 86±7 с. В качестве контроля использовали остановку кровотечения путем плотного прижатия к раневой поверхности тампона из марлевой салфетки. Остановка кровотечения происходила в контроле за 326±25 с.

Пример 13

Остановка капиллярно-паренхиматозного кровотечения выполнялась путем нанесения на рану губки, полученной по примеру 6. Губка хорошо адгезирует к ране, обладает высокой гигроскопичностью и полностью останавливает кровотечение за 63±6 с. В качестве контроля использовали остановку кровотечения путем плотного прижатия к раневой поверхности тампона из марлевой салфетки. Остановка кровотечения происходила в контроле за 362±25 с.

Предложенный кровоостанавливающий материал обладает высокой гемостатической активностью при остановке капиллярно-паренхиматозных кровотечений, что позволяет широко использовать его в различных областях медицины.