Способ оценки степени тяжести интоксикации

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике в медицине неотложных состояний и к экспериментальной медицине, и может быть использовано для оценки степени тяжести любой этиологии у пациентов и лабораторных животных.

Интоксикационный синдром является сопутствующим при большинстве заболеваний и патологических состояний и определение его степени имеет важное клиническое значение (Грачев С.В., Прохоренко И.Р., Прохоренко С.В. Роль белков крови в начальной стадии патогенеза эндотоксинового шока // Молекулярная медицина. - 2004. - №1. - С. 20-25; Титов В.Н. Экзогенные и эндогенные патологические факторы (патогены) как причина воспаления // Клин, лабор. диагностика - 2004. - №5. - С. 3-10; Афанасьев А.Н., Одинцова И.Н., Удут В.В. Синдромы эндогенной интоксикации и системного воспалительного ответа: общность и различия // Анестезиол. и реаниматол. - 2007, - №4. - С. 67-71; Чурляев Ю.А.; Григорьев Е.В.; Рейник В.Я. Способ оценки степени тяжести синдрома эндогенной интоксикации у больных в критическом состоянии // Патент РФ №2187810 от 22.05.2001). Своевременность выявления степени тяжести синдрома эндогенной интоксикации определяет набор, интенсивность и эффективность методов активной детоксикации организма.

В лабораторной практике для диагностики эндотоксикоза широко используют исследование в плазме крови молекул или пептидов средней массы (МСМ). Установлено, что эти соединения имеют различную структуру, а их молекулярная масса составляет 500-5000 дальтон. Увеличение оптической плотности супернатанта при длине волны 254 нм после осаждения белков сыворотки крови трихлоруксусной кислотой (ТХУ) отражает уровень малых патогенов, образованных in vivo при неконтролируемом протеолизе (Габриэлян Н.И., Дмитриев А.А., Севастьянова О.А и др. Средние молекулы и уровень эндогенной интоксикации у реанимационных больных // Анестезиол. и реаниматол. - 1985. - №1. - С. 36-38; Карякина Е.В., Белова СВ. Молекулы средней массы как интегральный показатель метаболических нарушений (обзор литературы) // Клин, лабор. диагностика. - 2004. - №3. - С. 3-8; Малахова М.Я. Метод регистрации эндогенной интоксикации: Пособие для врачей. - СПб., 1995. - 100 с.).

Недостатками известных способов оценки степени тяжести синдрома эндогенной интоксикации, основанных на исследовании в плазме крови молекул или пептидов средней массы (МСМ), являются:

1) многоэтапность и большие временные затраты, что делает невозможным использование способа для экспресс-анализа;

2) методика не автоматизирована и все манипуляции проводятся вручную, что влечет погрешности в результатах, связанные с индивидуальными профессиональными качествами лаборанта;

3) невозможность использования портативного оборудования и, как следствие, неприменимость для массовых и мониторинговых обследований.

Для оценки степени интоксикации любой этиологии уже более 70 лет пристальное внимание врачей всех специальностей привлекают расчетные индексы, отражающие соотношение различных классов лейкоцитов в составе периферической крови (Кальф-Калиф Я.Я. О лейкоцитарном индексе интоксикации и его практическое значение // Врач. дело. - 1941. - №1. - С. 31-35). Некоторые из них, такие как лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) Кальф-Калифа, ЛИИ Островского, ЛИИ Химич, ЛИИ Яблучанского, ядерный индекс Даштаянц Г.А. (ЯИД) характеризуют степень интоксикации (Абакумов М.М., Боровкова Н.В., Александрова И.В., Рей С.И., Хватов В.Б. Способ оценки степени тяжести эндогенной интоксикации // Патент РФ №2357248 от 11.12.2007; Кидалов В.Н.; Лысак В.Ф.; Макеев Б.Л. Способ оценки степени тяжести интоксикации организма // Патент РФ №2082971 от 13.05.1993). Другие свидетельствуют о наличии дисбаланса иммунной системы (Островский В.К., Мащенко А.В., Янголенко Д.В., Макаров С.В. Показатели крови и лейкоцитарного индекса интоксикации в оценке тяжести и определении прогноза при воспалительных, гнойных и гнойно-деструктивных заболеваниях // Клин. лабор. диагностика. - 2006. - №6. - С. 50-53).

Недостатками способов, основанных на лейкоцитарных расчетных индексах, являются:

1) дорогостоящие, так как требуют развернутого анализа крови и подготовленного персонала;

2) неприменимы при заболеваниях крови;

3) их информативность резко падает при наличии у больных иммунных нарушений и при проведении иммуностимулирующей терапии;

4) не отражают состояния организма (и, следовательно, интоксикации) при экзогенных токсикозах;

5) информативность ЛИИ как гематологического индекса в значительной степени зависит от времени заболевания и характеризует скорее наличие воспалительного процесса, чем интоксикации. Поэтому его необходимо использовать в совокупности с другими лабораторными и инструментальными исследованиями, обязательно учитывая клинические и анамнестические данные;

6) при длительном воспалительном процессе и тяжелой интоксикации организма он может снижаться (т.е. приближаться к "норме"), дезориентируя тем самым врача.

Известно, что при выраженном интоксикационном синдроме эндогенной и экзогенной этиологии усиливаются свободнорадикальные процессы и появляются в избыточных количествах активные формы кислорода (АФК), что приводит к перекисному окислению субстратов и появлению различных агрессивных факторов эндогенной природы в межклеточной среде и затем в крови, инициируя окислительный стресс (Панкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях: Пособие для врачей. - М.: РКНПК МЗ РФ, - 2001. - 78 с.; Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты. - М.: МАИК Наука, - 2001. - 343 с.). На принципе определения продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), модифицированных АФК белков существуют способы оценки интоксикационного синдрома (Голиков П.П., Николаева Н.Ю., Гавриленко И.А., Матвеев С.Б., Давыдов Б.В., Марченко В.В., Смирнов С.В., Лебедев В.В., Голиков А.П. Оксид азота и перекисное окисление липидов как факторы эндогенной интоксикации при неотложных состояниях // Патол. физиол. и эксперим. терапия. - 2000. - №2. - С. 6-9).

Недостатком этих способов является очень сложная взаимосвязь между степенью интоксикации и уровнем окислительного стресса, включающего не только процессы пероксидации, но и компенсаторной активации антиокислительных систем, нейтралирующих физиологичный избыток образованных АФК (антиоксиданты, акцепторы АФК, ферменты глютатионпероксидаза, супероксиддисмутаза), не позволяющая ставить знак равенства между синдромами интоксикации и окислительного стресса.

К другим недостаткам способа следует отнести трудоемкость анализа, использование реактивов из списка прекурсоров Федеральной службы Российской Федерации по контролю за оборотом наркотиков.

Наиболее современными методами диагностики степени эндогенной и экзогенной интоксикации является способ определения связывающей емкости альбумина в сыворотке крови путем добавления к сыворотке флюоресцентного вещества, взаимодействующего с альбумином, с последующим измерением количества получаемого продукта на флюориметре и сравнением его уровня с контрольной сывороткой (Мороз В.В., Кравченко-Бережная Н.Р., Мещеряков Г.Н., Закс И.О., Радаев С.М. Эффективная концентрация альбумина - маркер эндотоксемии при тяжелой механической травме // Анестезиол. реаниматол. - 2000. - №6. - С. 54-57; Грызунов Ю.А., Сыромятникова Е.Д., Ильяшенко К.К. Прогностическая ценность альбуминового флуоресцентного теста в оценке исхода острых отравлений психотропными средствами. Клиническая лабораторная диагностика, 2004, №11, стр. 39-42). В данном способе определяется общая (ОКА) и эффективная концентрация альбумина (ЭКА) и рассчитывается резерв связывающей способности альбумина (РССА), он же индекс токсичности (ИТ): ИТ=(ОКА/ЭКА) - 1, отражающий степень связывания альбумином токсичных субстанций в сыворотке крови (Грызунов Ю.А., Гринберг А.А., Ступин В.А., Родоман Г.В., Мусселиус С.Г., Федоровский Н.М., Добрецов Г.Е., Черныш Т.И., Шалаева Т.И., Пар В.И., Васина Н.В., Сыромятникова Е.Д., Наумов Е.К. Информативность показателя "эффективная концентрация альбумина" при распространенном перитоните: данные многоцентрового исследования // Анестезиол. и реаниматол. - 2003. - №6. - С. 32-35).

Данный способ находит все большее применение в крупных клиниках, однако необходимость специального дорогостоящего оборудования (флюориметров) и флюоресцентных зондов являются основным недостатком и препятствием для широкого использования данного метода оценки интоксикации.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения степени интоксикации на основе измерения связывающей емкости альбумина в сыворотке крови путем добавления к отцентрифугированной разбавленной в 120-2000 раз сыворотке флюоресцентного вещества N-карбоксифенилимид диметиламинонафталевой кислоты (К-35), избирательно взаимодействующего с альбумином, с последующим измерением количества получаемого продукта на флюориметре и сравнением его уровня с контрольной сывороткой (Миллер Ю.И., Добрецов Г.Е., Красовицкий Б.М., Корнилова Л.И., Ермоленко И.Г. Способ определения связывающей емкости альбумина в сыворотке крови // Авт. свидетельство №1681266 от 25.07.1989).

Недостатками прототипа являются:

1) необходимость специального дорогостоящего оборудования и флюоресцентных зондов;

2) дороговизна и малодоступность флюориметров, необходимых для практической реализации данного способа;

3) зависимость от фирм-поставщиков флюоресцентных зондов;

4) привязанность к оборудованию общеклинической лаборатории для определения общей концентрации альбумина;

5) потребность в высококвалифицированном персонале различных специальностей;

6) относительно высокая стоимость анализа;

7) ограниченность способа только сывороткой крови и невозможность использования способа для определения связывающей емкости альбумина в цельной крови, гемолизированной сыворотки, слюны и других биологических жидкостей.

Предлагаемый способ определения степени тяжести интоксикации основан на измерении степени снижения тепловой денатурации транспортных белков, адсорбировавших токсины.

Изобретение направлено на упрощение и повышение универсальности процедуры оценки степени тяжести интоксикации как у пациентов с подозрением на интоксикационный синдром, так и лабораторных животных при моделировании эндогенной или экзогенной интоксикации.

Указанный технический результат достигается тем, что первоначально измеряют концентрацию белка в пробе жидкого биологического материала (далее - биоматериала) человека или животного, затем пробу инкубируют в кипящей водяной бане в течение 3 минут, повторно определяют концентрацию белка в прогретой пробе и при снижении концентрации белка в пробе после прогревания более чем в 25 раз оценивают как отсутствие интоксикации, при снижении в 25-21 раз - как интоксикацию легкой степени, при снижении в 20-16 раза - как интоксикацию средней степени, а при снижении концентрации белка менее чем в 16 раз - как интоксикацию тяжелой степени.

В качестве жидкого биоматериала согласно заявленному способу можно использовать цельную кровь, сыворотку крови, плазму крови, ротовую жидкость, перитонеальную жидкость, эякулят, ликвор.

Предлагаемый способ основан на обнаруженной нами способности некоторых тканевых и плазменных белков выдерживать инкубирование в кипящей водяной бане в течение 3 минут.

Детальный анализ явления термостабильности комплекса белков с токсинами показал, что повышение их устойчивости к кипячению напрямую связано с межмолекулярными взаимодействиями низкомолекулярных веществ-лигандов и молекул средней массы с макромолекулами сывороточных белков-адсорбентов. Кроме того, предварительные эксперименты показали, что степень адсорбции белками эндо- и экзотоксинов и коэффициент термостабильности сывороточного белка находятся в зависимости от степени выраженности интоксикационного синдрома (таблица).

Определение концентрации белка в пробе может проводиться любым доступным биохимическим (Брэдфорд; Лоури) или иммунохимическим методом (радиальной иммунодиффузии в агаре по Манчини, иммунотурбидиметрии или «ракетного» иммуноэлектрофореза по Лоурелю с применением коммерческих антител к сывороточным белкам человека).

Если в качестве анализируемого биоматериала используется кровь или сыворотка, то требуется предварительное разбавление пробы в 5-10 раз, которое необходимо для профилактики гелеобразования и обеспечения для анализа жидкой фракции без хлопьев денатурированного белка. В этом случае измеряется концентрация белка в разбавленной пробе крови (сыворотки) до и после инкубирования в кипящей водяной бане. Если в качестве биоматериала используется ротовая жидкость, эксудатат или транссудат предварительного разбавления пробы не требуется.

Термическая обработка пробы биоматериала в кипящей водяной бане объясняется легкостью поддержания данного температурного параметра в условиях любой лаборатории (водяная баня). Использование более низких температур (например, термостатных 56°С и 65°С) не приводит к массивной тепловой денатурации белка, и степень денатурации белка в этих условиях не коррелирует со степенью тяжести интоксикационного синдрома.

Инкубирование пробы биоматериала в кипящей водяной бане в течение 3 минут подобрано эмпирически и является минимальной и достаточной для проявления эффекта термостабильности белка. При сокращении времени инкубирования в кипящей водяной бане пробы не успевают прогреваться и основная масса белка не успевает пройти стадию тепловой денатурации. Наоборот, увеличение времени инкубирования в кипящей водяной бане против заявленного увеличивает процент денатурации белка и требует расчета новых поправочных коэффициентов степени денатурации белка, соответствующих различным степеням тяжести интоксикации.

Присутствие гемоглобина и эритроцитов в крови и сыворотках увеличивает концентрацию белка в пробе до инкубирования в кипящей водяной бане и не искажает коэффициентов степени денатурации белка соответствующих различным степеням тяжести интоксикации.

Изложенная сущность изобретения поясняется таблицей.

В таблице приведены результаты определения концентрации белка (г/л) по методу Лоури в индивидуальных сыворотках крови пациентов с различной патологией, женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной гестозом (токсикозом), и здорового мужчины донора до и после инкубирования в кипящей водяной бане в течение 3 минут. Кроме сывороток в таблице приведены результаты определения концентрации белка в гемолизированной крови донора, сыворотке крови кролика и крысы и трех пробах слюны. В третьей колонке представлено отношение концентраций белка, названное нами степенью снижения концентрации белка, и являющегося частным от деления результата в первой колонке на результат во второй колонке.

Для объективной характеристики степени интоксикации у пациентов с различной патологией, представленной в таблице, для каждого из них в четвертой колонке приведены два показателя интоксикации - лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) и уровень молекул средней массы (МСМ).

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию на кафедрах биологической химии, патологической физиологии, факультетской хирургии, урологии, акушерства и гинекологии лечебного факультета, анестезиологии и реаниматологии Астраханского государственного медицинского университета в течение 2004-2015 гг., в отделении патологии беременности Астраханского городского клинического роддома, травматологическом отделении, отделении гемодиализа и отделении реанимации и интенсивной терапии НУЗ «МСЧ» г. Астрахани у 75 пациентов.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1. У донора №6714 концентрация белка в пробе сыворотки крови, измеренная методом Лоури, составила 77,8 г/л (таблица), после инкубирования разбавленной в 5 раз пробы этой сыворотки крови в кипящей водяной бане в течение 3 минут концентрация белка в пробе снизилась до 0,48 г/л, что в переводе на неразбавленную сыворотку донора после прогревания составило 2,4 г/л (таблица). Снижение концентрации белка в пробе после прогревания составило 77,8/2,4=32,4 раза (таблица), что характеризует сыворотку как биоматериал от пациента с отсутствием интоксикации.

В сыворотке крови этого же донора после осаждения белков трихлоруксусной кислотой (ТХУ) путем измерения оптической плотности супернатанта при длине волны 254 нм определяли концентрацию молекул средней массы (МСМ), которая составила 0,102 опт. ед. (таблица), что также соответствует норме и отсутствию интоксикации (Габриэлян Н.И., Дмитриев А.А., Севастьянова О.А и др. Средние молекулы и уровень эндогенной интоксикации у реанимационных больных // Анестезиол. и реаниматол. - 1985. - №1. - С. 36-38).

Из крови этого же донора готовился мазок и проводился просмотр окрашенного препарата крови под микроскопом с ручным подсчетом лейкоцитарной формулы и дифференцированным подсчетом молодых форм нейтрофилов. Лейкограмма этой же пробы крови: лейкоциты 4,5×10⁹/л, нейтрофилы 49% (сегменты 47%, палочки 2%, юные 0%), лимфоциты 40%, базофилы 1%, моноциты 8%, эозинофилы 2%, миелоциты и плазмоциты 0%. ЛИИ вычисленный по формуле Кальф-Калифа

составил 0,35.

С целью сопоставления с клиническими данными, приведенными в таблице, ЛИИ Кальф-Калифа вычислялся также на основании данных гематологического анализатора по модифицированной формуле Костюченко А.Л. и соавт. (Назаренко Г.И., Кишкун А.Л. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. - М.: Медицина, 2000. - 544 с.):

Авторы модифицированного метода установили, что норма ЛИИ составляет от 0,5 до 1,5. Результат ЛИИ донора 0,43 (таблица). Диагноз по ЛИИ: интоксикация у донора отсутствует.

Все три модели интоксикации показали одинаковый результат: интоксикация у донора отсутствует.

Пример 2. Больной Д., 39 лет, госпитализирован в ожоговое отделение Негосударственного учреждения здравоохранения «Медико-санитарная часть» ООО «Газпром Добыча Астрахань» 13.06.2009 г. с диагнозом: Ожог пламенем II-III ст. спины, задних поверхностей обеих нижних конечностей, площадь ожога 35%, ожоговый шок. С 14.06.2009 г. клинические признаки ожоговой токсемии, олигурия. В крови от 17.06.09 г. отмечается лейкоцитоз (до 11×10⁹/л), индекс интоксикации Кальфа-Калифа 16,5 (таблица), что свидетельствует об интоксикации тяжелой степени. В сыворотке крови содержание молекул средней массы составило 0,890 опт. ед. (таблица), что также соответствует интоксикации тяжелой степени.

Инкубирование разбавленной в 5 раз пробы сыворотки крови этого больного в кипящей водяной бане и последующие расчеты проводились, как в примере 1. На фоне массивной инфузионно-трансфузионной терапии концентрация белка в сыворотке крови после инкубирования в кипящей водяной бане снизилась только в 14,7 раза (таблица), что подтверждает диагноз тяжелая степень эндогенной интоксикации (ожоговой токсемии).

Пример 3. Беременная С., 27 лет, первая одноплодная беременность 32 недели, госпитализирована в отделение патологии Александро-Мариинской областной клинической больницы с гестозом с клиническими симптомами преэклампсии. Инкубирование разбавленной сыворотки крови этого больного в кипящей водяной бане и последующие расчеты проводились, как в примере 1. Все три показателя интоксикации ЛИИ 8,54, МСМ 0,620 опт. ед. и степень снижения концентрации белка после инкубирования в кипящей водяной бане в 19,8 раз (таблица) согласованно указывают на интоксикацию средней степени тяжести.

Пример 4. У больного И., находящегося в состоянии алкогольного опьянения средней степени, доставленного бригадой скорой помощи из общественного места в токсикологическое отделение ГБУЗ АО ГКБ №3 им. Кирова с диагнозом алкогольно-токсическая кома через два часа после поступления все три показателя интоксикации ЛИИ 3,58, МСМ 0,218 опт. ед. и степень снижения концентрации белка после инкубирования в кипящей водяной бане в 20,7 раз (таблица) указывают на интоксикацию легкой степени.

Пример 5. В сыворотках крови лабораторных животных (кролик породы Шиншилла, белая крысы линии Вистар), содержащихся в клетках вивария Астраханского государственного медицинского университета и не использовавшихся ранее в научных экспериментах, концентрация белка до инкубирования в кипящей водяной бане соответствует физиологическим нормам для данной группы лабораторных животных, а степень снижения концентрации после инкубирования в кипящей водяной бане сывороток (таблица) соответствует контрольным значениям у доноров - в 29,7 раз и в 29,0 раз соответственно (диагноз: интоксикация отсутствует).

Пример 6. У здорового годовалого ребенка Б., имеющего 4 резца, при осмотре десен без признаков прорезывания следующих молочных зубов, со слов матери в течение последнего месяца практически здорового, в собранной слюне концентрация белка после инкубирования в кипящей водяной бане снизилась в 28 раз (таблица), что соответствует диагнозу: отсутствие интоксикации. Инкубирование ротовой жидкости ребенка в кипящей водяной бане и последующие расчеты проводились как в примере 1, но ротовая жидкость перед прогреванием не разводилась.

Пример 7. Больной X., 45 лет, обратился в частную стоматологическую клинику по поводу правостороннего флюса в течение трех дней. При осмотре общее состояние средней тяжести, выставлен диагноз одонтогенный гнойный периостит, интоксикационный синдром. Перед вскрытием абсцесса проведено исследование слюны и крови на показатели интоксикации: ЛИИ 4,37, МСМ 0,420 опт. ед. и степень снижения концентрации белка после инкубирования в кипящей водяной бане в слюне в 19,1 раз (таблица), а в крови - в 17,8 раз, что указывает на интоксикацию средней степени. Инкубирование ротовой жидкости этого больного в кипящей водяной бане и последующие расчеты проводились, как в примере 6.

Обнаружен параллелизм результатов оценки интоксикационного синдрома по слюне и крови, несмотря на более низкое содержание белка в ротовой жидкости по сравнению с сывороткой крови (в десятки раз).

Предлагаемым способом достигается следующий положительный эффект:

- техническая простота, незначительные трудозатраты (для практического исполнения способа достаточно 1 специалиста);

- нет необходимости в очистке белка, стадиях фильтрации и центрифугирования и обработке пробы реагентами;

- возможность использования для реализации способа помимо крови любой другой биологической жидкости (сыворотки, ротовой жидкости, ликвора, экстракта, экссудата, транссудата и т.д.);

- экономичность (способ не требует эксклюзивного и дорогостоящего оборудования и реактивов, вспомогательной аппаратуры и высококвалифицированного медперсонала);

- универсальность способа (определение концентрации белка можно производить любым доступным способом);

- доступность реактивов, необходимых для практической реализации данного способа;

- возможность экспресс-модификации теста;

- возможность неинвазивной модификации (слюна);

- возможность широкого использования способа на животных в экспериментах по моделированию интоксикации.

Предлагаемым способом достигается упрощение и повышение универсальности процедуры оценки степени тяжести интоксикации.

Внедрение данного способа не требует значительных затрат, позволит повысить производительность определения степени интоксикации у человека или экспериментальных животных.

Предлагаемый способ может быть использован как для научных экспериментов, так и в клинической практике как дополнительный тест для диагностики степени тяжести экзогенного и эндогенного интоксикационного синдрома.