Результат интеллектуальной деятельности: Способ фиторемедиации почвы, загрязненной углеводородами, и применение штамма микроорганизма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д в качестве стимулятора роста растений

Изобретение относится к сфере экобиотехнологии и может быть использовано при биологическом способе очистки почв, которые подверглись загрязнению нефтью и нефтепродуктами.

В настоящее время для очистки загрязненных нефтью почв успешно применяют физические, химические и биологические методы. Наиболее перспективными и экономически выгодными является биологический метод, при котором возможна реализация двух стратегий осуществления биоремедиации:

- использование только биопрепаратов-деструкторов углеводородов;

- посев растений-фиторемедиантов, которые формируют в области своей корневой системы сообщество микроорганизмов, способных разрушать поллютанты;

- совместное использование деструктивного потенциала бактерий (несколько реже грибов), обладающих высокой деструктивной активностью, с метаболическими возможностями высших растений. Такое использование обеспечивает более устойчивый и эффективный процесс очистки благодаря высокой скорости адаптации растений за счет жизнедеятельности бактерий, а также взаимовыгодной стратегии сосуществования между растениями и микроорганизмами. Кроме того, не требуется больших финансовых вложений и энергозатрат, т.е. способ является экономически выгодным и перспективным при очистке загрязненных токсикантами территорий.

Известен способ получения растительно-микробных ассоциаций для фиторемедиации на основе микроразмножаемых растений томата, рапса и арабидопсиса и плазмидосодержащих ризосферных бактерий, обладающих антимикробной активностью против бактерий вида Erwinia carotovora и грибов вида Phytophthora infestans, характеризующийся тем, что колонизируют посадочный материал культивируемых in vitro растений штаммом Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2500 Д, несущим плазмиды pBS216, pKS1, придающие устойчивость ему к нафталину и мышьяку, или Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2501 Д, несущим плазмиды pBS216, pBS501, придающие устойчивость ему к нафталину и никелю (патент RU №2443771, МПК C12N 1/00 (2006.01), C12N 1/14 (2006.01), A01N 63/00 (2006.01), В09С 1/10 (2006.01)).

Способ позволяет защитить растения от токсического воздействия нафталина и тяжелых металлов, а также повышает устойчивость растений к фитопатогенным микроорганизмам, однако способ не предполагает использования получаемых растительно-микробных ассоциаций в условиях нефтяного загрязнения.

Известен способ выращивания многолетних трав на нефтезагрязненной почве, включающий посадку многолетних трав в нефтезагрязненную почву (патент RU №2249933, МПК⁷ А01В 79/02, В09С 1/00). При этом многолетние травы предварительно выращивают не менее одного вегетационного периода в незагрязненной почве с последующим высаживанием в почву корневищами, и/или столонами, и/или рассадой. В качестве многолетних трав используют клевер гибридный (Trifolium hybridum L.), клевер луговой (Т. pratense L.), ежу сборную (Dactylisglo merata L.), тимофеевку луговую (Phleum pratense L.), кострец безостый (Bromopsis mermis (Leys.) Holub.), пырей ползучий (Elytrigia repens (L.) Nevski), тысячелистник обыкновенный (Achillea millefolium L.), овсяницу луговую (Festuca pratensis Huds), клевер ползучий (Т. repens).

Однако данный способ трудоемок, так как для его реализации требуется дополнительное время для выращивания и ухода за посевным материалом.

Известен способ биорекультивации нефтезагрязненных почв с использованием микроорганизмов (патент RU 2253209, МПК А01В 79/02). На участок нефтезагрязненной почвы высаживают предпочтительно растения, формирующие в своей прикорневой зоне микробное сообщество с повышенным их содержанием и одновременно повышенными эмульгирующими свойствами, причем биомасса подземной части растений должна составлять не менее 71,8 г/м² в пересчете на сухой вес или 143,6 г/м² сырого веса биомассы. Используют следующие растения: клевер луговой, клевер ползучий, кострец безостый, полевица тонкая, пырей ползучий, мятлик луговой, ежа сборная, тимофеевка луговая, овсяница луговая, тысячелистник обыкновенный.

Недостатком способа является очистка нефтезагрязненной территории за счет потенциала аборигенной микрофлоры, активность которой может зависеть от условий окружающей среды и произрастающей растительности.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ фиторемедиации грунта, загрязненного углеводородами, включающий посев растений-фиторемедиантов, в качестве которых используют смесь семян бобовых растений, а также люцерну посевную и семена злаковых растений: райграс пастбищный, и/или рожь озимую, и/или сорго веничное, в соотношении 1:1-3, предварительно бактеризованных штаммом микроорганизма деструктором углеводородов, стимулирующим рост растений, в качестве которого использован штамм Sinorhizobium meliloti Р221 или штамм Azospirillum braselense SR80 (патент RU 2403102, МПК В09С 1/10 (2006.01)). Перед посевом в грунт вносят минеральное азотное удобрение в количестве не менее 120 г/м². Бактеризацию проводят погружением семян в суспензию, содержащую клетки штамма микроорганизма в концентрации 1-3⋅10⁸ клеток/мл с последующим выдерживанием семян в суспензии в течение 2-3 ч. В качестве минерального азотного удобрения используют аммиачную селитру.

Недостатком данного способа является ограниченная применимость при высоких концентрациях углеводородов: данный способ фиторемедиации может быть применен для очистки почвы с концентрацией нефтепродуктов до 30 г/кг грунта.

Известно применение родококков для задержки процессов развития растений (патент RU №2482681, МПК A01N 63/00 (2006.01), C12N 1/20 (2006.01)). На растение или часть растения воздействуют одной или более бактериями, продуцирующими один или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из нитрилгидратаз, амидаз, аспарагиназ и их смесей. Указанную одну или более бактерий выбирают из группы, состоящей из видов Rhodococcus, Brevibacterium ketoglutamicum, и их смесей, и при этом указанная одна или более бактерий воздействуют на растение или часть растения в количестве, достаточном для задержки процесса развития растений.

Однако известно применение родококков в составе биопрепарата, который представляет собой ассоциацию штаммов бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-10997, Bacillus subtilis ВКПМ В-10999 и Rhodococcus erythropolis ВКПМ - Ас-1882 в массовом соотношении (1-2):(1-2):1 и обладающий стимулирующим рост растений активностью (патент №2484131 RU, МПК C12N 1/26 (2006.01), C02F 3/34 (2006.01), В09С 1/10 (2006.01), C12R 1/125 (2006.01), C12R 1/01 (2006.01), C12R 1/40 (2006.01)). Биопрепарат дополнительно содержит сорбент, органические, минеральные и стимулирующие добавки. Его вводят в виде водного раствора путем дождевания в загрязненный грунт, почву или промышленный сток в эффективном количестве.

Использование в составе описанного биопрепарата штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ-Ас-1882 не раскрывает его фитостимулирующую активность.

Техническим результатом является высокая скорость очистки почв, загрязненных сырой нефтью, и применение способа на сильно загрязненных почвах.

Технический результат достигается за счет использования растительно-микробной ассоциации, включающей в себя люцерну посевную Medicago sativamm пшеницу озимую Triticum durum и суспензию клеток штамма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д, совместно с содержащей фитогормоны средой культивирования следующего состава, г/л: KNO₃ - 4; Na₂HPO₄ - 1,4; KH₂PO₄ - 0,4; MgSO₄×H₂O - 0,8; сахароза - 10; триптофан - 1.

Применение штамма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д в качестве фитостимулятора роста растений.

Признаками общими с прототипом являются:

- посев растений-фиторемедиантов, в качестве которых используют семена люцерны посевной и семена злаковых растений;

- применение суспензии штамма микроорганизма - деструктора углеводородов, стимулирующего рост растений.

Отличительными признаками от прототипа являются применение:

- в качестве растений семян люцерны посевной Medicago sativa или пшеницы озимой Triticum durum;

- в качестве штамма микроорганизма - деструктора углеводородов, стимулирующего рост растений суспензии клеток штамма микроорганизма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д совместно с содержащей фитогормоны средой культивирования следующего состава, г/л: KNO₃ - 4; Na₂HPO₄ - 1,4; KH₂PO₄ - 0,4; MgSO₄×H₂O - 0,8; сахароза - 10; триптофан - 1.

Выбранные растения используются в технологии фиторемедиации почв загрязненных различными поллютантами.

В качестве микроорганизма - интродуцента использовали штамм Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д, который депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Непатогенность данного микроорганизма была доказана в остром опыте на белых мышах и токсикологических исследованиях, проведенных Научно-исследовательским центром токсикологии и гигиенический регламентации биопрепаратов Министерства здравоохранения РФ. Используемый штамм является высокоактивным деструктором различных нефтепродуктов и индивидуальных углеводородов в широком диапазоне температур и значений рН (патент RU №2317162, МПК В09С 1/10 (2006.01), C12N 1/26 (2006.01)).

На чертеже представлены фотоснимки растительности на экспериментальных участках, описанных в примере 4.

Пример 1. Отбор нефтеокисляющего штамма с фитостимулирующей активностью.

Скрининг культур микроорганизмов на фитостимулирующую активность проводили в присутствии нефтепродуктов на песке. Песок предварительно промывали от органических остатков, просеивали через сито с диаметром пор 2 мм, стерилизовали в сухожаровом шкафу 3 ч при температуре 180°С. В качестве поллютанта использовали сырую Западно-Сибирскую нефть, которая вносилась в концентрации 5% от массы песка, составившей 50 г в чашке Петри. Для равномерного распределения гидрофобных поллютантов их вносили в виде раствора в гексане. Растительным тест-объектом являлся редис обыкновенный (Raphanus sativus), который обладает высоким уровнем отзывчивости на наличие фитогормонов в среде. Критериями оценки являлись такие параметры как всхожесть (7 сутки) и приживаемость (10 сутки). Песок с внесенными в него семенами обрабатывался суспензиями клеток штаммов микроорганизмов объемом 5 мл с титром жизнеспособных клеток 10⁷ КОЕ/мл. В ходе эксперимента было выявлено, что из 25 штаммов исследуемых культур наиболее ярко влияние на показатели всхожести и приживаемости проявлялось при обработке суспензией клеток штамма микроорганизма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д, при внесении которой показатели всхожести были в 1,5 раза выше по сравнению с контролем.

Эффект обнаруживается при концентрации углеводородов до 50 г/кг.

Для оценки количества синтезируемого фитогормона проводили качественную реакцию на индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) с реактивом Сальковского, состоящего из 0,05 М FeCl₃ в 37% растворе хлорной кислоты HClO₄. Осаждение клеток проводили на центрифуге Dastan РС-6 МЦ (Киргизия) в течение 20 мин при 3000 об/мин. К 2 мл исследуемого образца добавляли 1 мл реактива. Измерение оптической плотности производили на колориметре фотоэлектрическом КФК-2 МП (Россия) при длине волны 540 нм. В контрольную кювету помещалась минеральная среда и добавленный в нее реактив Сальковского. В качестве источников энергии и углерода выступали сахароза и гексадекан; триптофан вносили в концентрации 0,5 г/л минеральной среды, их влияние на концентрацию ИУК отражено в таблице 1.

Если источником углерода выступала сахароза, то максимальная концентрация фитогормона в 34,42 мкг/мл наблюдалась при температуре 15°С; на гексадекане- отмечена при температуре 25°С и составила 77,69 мкг/мл.

Пример 2. Наработка биомассы клеток штамма фитостимулирующего нефтеокисляющего микроорганизма и фитогормона.

Штамм Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д выращивали во флаконах на жидкой минеральной среде следующего состава, г/л: KNO₃ - 4; Na₂HPO₄ - 1,4; KH₂PO₄ - 0,4; MgSO₄×H₂O - 0,8. В качестве источника углерода использовали сахарозу в концентрации 10 г/л среды. Предшественником в биосинтезе фитогормонов выступал триптофан, который добавляли в среду в концентрации 1 г/л. Культивирование микроорганизма проводили в течение 4 суток при 120 об/мин на орбитальных шейкерах Biosan PSU-20i (Латвия), после чего суспензия штамма микроорганизма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д была готова к совместному использованию с растениями для очистки загрязненной нефтью почвы.

Пример 3. Очистка нефтезагрязненной почвы.

Иследовали фиторемедиацию почвы, загрязненной сырой нефтью в концентрации 50 г/кг. Нефть вносили в виде раствора в гексане для равномерного распределения в почве. Перед посевом люцерны посевной Medicago sativa или пшеницы озимой Triticum durum производили внесение в нефтезагрязненную почву суспензию штамма микроорганизма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д, полученную в ходе культивирования согласно примеру 2. Семена выбранных растений сеяли по 30 штук в однолитровые вегетационные сосуды, которые содержали 300 г почвы с внесенной в нее сырой нефтью, как описано выше. В течение 30 суток растения выращивали при температуре 27°C/20°C (днем/ночью) и их полив производили по мере необходимости. Измерение остаточного количества углеводородов проводили гравиметрическим методом.

Из таблицы 2 видно, что наименьшее остаточное количество углеводородов обнаруживалось в среде, в которой произрастала пшеница при обработке суспензией штамма микроорганизма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д. При ее внесении в почве наблюдается убыль содержания углеводородов по сравнению с вариантом без обработки бактериями: в случае с пшеницей на 16,8%; с люцерной - 13,6%; без вегетации растений - 28,8%.

Пример 4. Использование штамма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д в качестве стимулятора роста растений.

Эксперимент проводили в почвенных условиях городской среды с высевом газонной травосмеси (Festuca rubra 30%, Lolium perenne 30%, Poa pratensis 20%, Festuca rubratrichophylla 15%, Festuca ovina 5%). Ha территории Кубанского государственного университета были заложены 5 площадок площадью по 0,1 м² на участке почвы с отсутствующей естественной растительностью. Каждая из них засевалась газонной травой и обрабатывалась индивидуально биологическим или химическим агентом каждые 5 дней в течение 20 суток. Участок №1 обрабатывали бесклеточной культуральной жидкостью, полученной удалением клеток Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д из исходной жидкой культуры посредством центрифугирования 20 мин при 3000 g; участок №2 - биомассой клеток Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д (суспензией клеток в воде); участок №3 - цельной жидкой культурой исследуемого штамма, представляющей собой суспензию клеток штамма микроорганизма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д совместно с содержащей фитогормоны средой культивирования; участок №4 - раствором химически синтезированной индолил-3 - уксусной кислоты в сходной с содержанием этого фитогормона в бесклеточной культуральной жидкости концентрации 50 мг/л; участок №5 (контроль) - соответствующим объемом воды. В результате обработки на участках №1 и №3 наблюдали увеличение интенсивности вегетации выбранной газонной травосмеси. Меньший эффект отметили на участке №2. Это подтверждает, что положительный эффект на рост и развитие оказывает не только биомасса клеток Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д, но и те метаболиты, которые образуются в ходе жизнедеятельности данного штамма и способные накапливаться в среде культивирования (см. чертеж).

Применение растительно-микробной ассоциации позволяет очищать на 67% более загрязненную почву нефтепродуктами по сравнению с прототипом. Не требуется предварительного внесения минеральных удобрений и способ упрощается, а сроки очистки сокращаются в 3-4 раза. Данный способ может быть использован во всех отраслях промышленности, которые связаны с добычей, транспортировкой, хранением и ликвидацией аварийных разливов нефти и нефтепродуктов. Кроме того, в ходе экспериментов было выявлено, что штамм микроорганизмов Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д можно применять в качестве стимулятора роста растений.