×
25.08.2017
217.015.c276

СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО МЕТОДОМ КУЛЬТУРЫ ПОЧЕК IN VITRO

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
№ охранного документа
0002617944
Дата охранного документа
28.04.2017
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области сельского хозяйства. Изобретение представляет собой способ размножения трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro, включающий выделение почек из поверхностно стерилизованных в течение 5 мин в 0,1%-ном водном растворе диоцида и 4-5 раз промытых в стерильной воде отрезков стеблей длиной 1,5-2.0 см с пазушными почками вегетирующих трансгенных растений клевера лугового и помещение их на агаризованную питательную среду Гамборга В, где вначале отрезки стеблей с пазушными почками длиной 1,5-2,0 см промывают в проточной водопроводной воде (10 мин) и после поверхностной стерилизации при встряхивании отделенные пазушные почки культивируют на агаризованной среде Гамборга В с 2,0 мг/л БАП до размера не менее 4,0 мм, а затем 4 пассажа на агаризованной среде Гамборга В с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина до образования морфогенной ткани только с зелеными побегами, при этом размноженными трансгенными (канамицин устойчивыми) растениями являются растения-регенеранты клевера лугового, образовавшие корни не менее 50 мм на агаризованной среде Гамборга В с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина. Изобретение позволяет повторно вводить в культуру in vitro трансгенные растения клевера лугового, получать длительно культивируемую морогенную ткань, изучать экспрессию введенных генов в вегетативно размноженных трансгенных растениях клевера лугового. 2 табл., 2 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано для получения и поддержания коллекции трансгенных растений клевера лугового с ценными признаками, в исследованиях по физиологии и генетике растений.

Известен способ регенерации растений клевера лугового при генетической трансформации [1].

Регенерацию растений осуществляют из культивируемой трансформированной морфогенной культуры клевера на питательной среде Гамборга В5 с добавлением канамицина и цефотаксима, причем морфогенную культуру получают без образования дедифференцированной ткани путем культивирования гипокотиля на питательной среде Гамборга В5 с добавлением с 4,0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП), 1,0 мг/л кинетина и 0,05 мг/л α-нафтилуксусной кислоты (НУК) с дальнейшей пересадкой эксплантов на свежую среду того же состава с 2,0 мг/л БАП, а эпикотильную часть проростков сохраняют путем культивирования на среде Гамборга В5 без гормонов или путем микроразмножения на среде того же состава с добавлением 2,0 мг/л БАП.

К недостаткам данного способа можно отнести следующее. Использование как эпикотильной, так и гипокотильной частей проростков для размножения созданных трансгенных растений невозможно, так как полученные растения были бы следующего семенного поколения. Получение же растений-регенерантов из морфогенных культур 24-х и более пассажей иногда невозможно в связи с их гибелью в результате инфицированности. В связи с этим возникает необходимость повторного введения в культуру вегетирующих трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro.

Имеются методические указания по регенерации и размножению клевера лугового в культуре in vitro [2]. Регенерация растений клевера лугового осуществляется путем выделения почек из поверхностно стерилизованных в течение 5 мин в 0,1-ном водном растворе диоцида и 4-5 раз промытых в стерильной воде отрезков стеблей длиной 1,5-2,0 см с пазушными почками вегетирующих растений клевера лугового и помещения их на агаризованную питательную среду Гамборга В5.

К недостаткам этого способа можно отнести следующее. Питательная среда содержит уменьшенную вдвое концентрацию всех входящих в ее состав компонентов. Это способствует быстрой регенерации интактных растений клевера лугового с корнями, но не обеспечивает образования морфогенной ткани, необходимой для длительного поддержания в культуре in vitro коллекции трансгенных растений клевера лугового. Кроме того, размножение данным способом осуществляется на питательных средах, не содержащих селективный фактор - канамицин. Это значительно увеличивает риск получения в процессе размножения нетрансгенных растений.

Цель изобретения - разработка способа размножения трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro, позволяющего повторно вводить в культуру in vitro трансгенные растения клевера лугового, получать длительно культивируемую морфогенную ткань, изучать экспрессию введенных генов в вегетативно размноженных трансгенных растениях клевера лугового.

В предлагаемом способе поставленная цель достигается тем, что выделенные из поверхностно стерилизованных в течение 5 мин в 0,1%-ном водном растворе диоцида и 4-5 раз промытых в стерильной воде отрезков стеблей длиной 1,5-2,0 см с пазушными почками вегетирующих трансгенных растений клевера лугового почки помещают на агаризованную питательную среду Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и культивируют до размера не менее 4,0 мм, а затем 4 пассажа на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина до образования морфогенной ткани только с зелеными побегами, при этом размноженными трансгенными (канамицин устойчивыми) растениями считаются зеленые регенераты клевера лугового, образовавшие корни не менее 50 мм на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина.

Способ осуществляется следующим образом.

Отрезки стеблей с пазушными почками длиной 1,5-2,0 см промывали в проточной водопроводной воде (10 мин) и поверхностно стерилизовали в течение 5 минут в 0,1%-ном водном растворе диоцида (при встряхивании). После стерилизации отрезки стеблей 4-5 раз промывали автоклавированной (стерильной) водой. Затем от них отделяли пазушные почки, которые помещали на агаризованную питательную среду Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП. После 3-4-х недель культивирования почки размером не менее 4 мм и без видимых признаков инфицированности помещали на питательную среду того же состава, но с добавлением 50 мг/л канамицина (селективного фактора). Морфогенную ткань, образующуюся из почек на селективной среде, делили на части, отбраковывая альбиносные побеги. После 4-х пассажей на селективной среде отбирали морфогенную ткань только с зелеными побегами. Образовавшиеся из них на селективной среде растения с корнями не менее 50 мм высаживали в вегетационные сосуды с почвой.

Пример 1.

Влияние размера эксплантов на выживаемость почек клевера лугового в культуре in vitro.

Проводили микроразмножение вегетирующих трансгенных растений клонов LGVac2 и Tr Топ12 клевера лугового, созданных с помощью генетических конструкций, содержащих селективный ген канамицинустойчивости [3]. Отрезки стеблей с почками брали с вегетирующих растений в фазе цветения. Поверхностно простерилизованные пазушные почки помещали по 30 шт. в чашки Петри с питательной агаризованной средой Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП. После 3-х недель культивирования часть неинфицированных эксплантов пересаживали на агаризованную среду Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина и без него. Все почки клевера лугового размером менее 4,0 мм на селективной среде к 20-му дню культивирования погибли (табл. 1), тогда как почки не менее 4,0 мм на той же среде оставались зелеными.

1. Влияние размера эксплантов на выживаемость почек клевера лугового в культуре in vitro

Таким образом, чем больше размер эксплантов (почки), помещенных на селективную среду с канамицином, тем больше (в 4,4-9,5 раз) выживших эксплантов к 3-4 неделе культивирования. При этом несколько возрастает число инфицированных эксплантов у LGVac2 и Tr Топ12 1,4-1,8 раз на селективной среде и в 1,7-2,2 раза в контроле (без канамицина). Однако в вариантах с эксплантом размером меньше 4,0 мм у LGVac2 не было ни одного зеленого экспланта и только 0,1% - у Tr Топ12, в то время как в вариантах с эксплантами не менее 4,0 мм как у LGVac2, так и у Tr Топ12 к 3-4 неделе культивирования на селективной среде число зеленых эксплантов отличалось от контроля на 15,4 и 0,2% соответственно.

Пример 2

Получение морфогенной ткани с зелеными побегами у трансгенных растений клевера лугового на селективной питательной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина.

Для получения морфогенной ткани с зелеными побегами на агаризованную питательную среду Гамборга В5 с 2 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина помещали почки зеленого цвета не менее 4,0 мм и субкультивировали несколько пассажей на среде того же состава до получения морфогенной ткани с зелеными побегами.

Почки зеленого цвета после повторного культивирования на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина формировали в зависимости от пассажа морфогенную ткань со смешанными (зелеными и альбиносными) или только зелеными побегами (табл. 2).

2. Получение морфогенной ткани с зелеными побегами у трансгенных растений клевера лугового на селективной среде с 50 мг/л канамицина

При каждом последующем пассаже на селективную среду того же состава помещали части морфогенной ткани только с зелеными побегами, которые через 20-25 дней культивирования формировали различное число морфогенных культур клевера лугового.

Количество морфогенных культур со смешанными побегами (зелеными и альбиносными) возрастало к 3-му пассажу с 0% до 43,4% и 39,1% и уменьшалось к 4-му до 8,3% и 10,1% у LGVac2 и Tr Топ12, соответственно, т.е. химерность морфогенных культур проявлялась только ко 2 и 3-му пассажу.

В связи с этим в 1-м пассаже наблюдались культуры только с зелеными побегами. При этом их число уменьшалось к 3-му пассажу до 49,1% и 59,4% в связи с проявлением химерности, а так как для каждого последующего пассажа отбирали части морфогенной ткани только с зелеными побегами, отбраковывая альбиносные побеги, то их число возрастало до 91,9% и 89,3% LGVac2 и у Tr Топ12 соответственно. После 4-х пассажей на селективной среде отбирали морфогенную ткань только с зелеными побегами. Образующиеся из них на селективной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина растения-регенеранты с корнями не менее 50 мм высаживали в вегетационные сосуды с почвой для получения семян.

Таким образом, для получения канамицинустойчивых трансгенных растений клевера лугового почки поверхностно стерилизуют и сначала культивируют на агаризованной питательной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП в течение 3-4 недель без селективного фактора, а затем 4 пассажа на среде того же состава, но с добавлением 50 мг/л селективного фактора канамицина. Растения-регенеранты с корнями не менее 50 мм получают на селективной среде из зеленых побегов морфогенной ткани, не имеющей альбиносных побегов из 4-го пассажа.

Разработанный способ позволяет повторно вводить в культуру in vitro трансгенные растения клевера лугового, получать длительно культивируемую морфогенную ткань, изучать экспрессию введенных генов в вегетативно размноженных трансгенных растениях клевера лугового.

Источники информации

1. Пат. 2305931 РФ, МПК А01Н 4/00, А01Н 5/00, A01G 7/00. Способ регенерации растений клевера лугового при генетической трансформации / Солодкая Л.А., Агафодорова М.Н., Куренина Л.В., Лапотышкина Л.И. (РФ). - №2005117826/13: заявлено 09.06.2005; опубл. 20.09.2007. - Бюл. №26. - 6 с.

2. Мезенцев А.В., Любавина Л.А. Методические указания по регенерации и размножению клевера лугового в культуре in vitro. – М., 1983. - 17 с.

3. Пат. 2420060 РФ, МПК А01Н 4/00. Способ генетической трансформации растений селекционно-ценных образцов клевера лугового. / Солодкая Л.А.. Лапотышкина Л.И., Клименко И.А., Агафодорова М.Н. (РФ). - №200914286/10: заявлено 18.11.2009; опубликовано 10.06.2011. - Бюл. №16. - 8 с.

Способ размножения трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro, включающий выделение почек из поверхностно стерилизованных в течение 5 мин в 0,1%-ном водном растворе диоцида и 4-5 раз промытых в стерильной воде отрезков стеблей длиной 1,5-2,0 см с пазушными почками вегетирующих трансгенных растений клевера лугового и помещение их на агаризованную питательную среду Гамборга В, отличающийся тем, что вначале отрезки стеблей с пазушными почками длиной 1,5-2,0 см промывают в проточной водопроводной воде (10 мин) и после поверхностной стерилизации при встряхивании отделенные пазушные почки культивируют на агаризованной среде Гамборга В с 2,0 мг/л БАП до размера не менее 4,0 мм, а затем 4 пассажа на агаризованной среде Гамборга В с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина до образования морфогенной ткани только с зелеными побегами, при этом размноженными трансгенными (канамицин устойчивыми) растениями являются растения-регенеранты клевера лугового, образовавшие корни не менее 50 мм на агаризованной среде Гамборга В с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-8 из 8.
20.04.2016
№216.015.338e

Способ маркирования сортов-популяций люцерны

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Изобретение представляет собой способ маркирования сортов-популяций люцерны, включающий при скрещивании родительских пар удаление верхней части паруса распустившегося цветка, осуществление искусственного триппинга, помещение соцветия в гипотонический...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002582267
Дата охранного документа: 20.04.2016
10.05.2016
№216.015.3cc0

Способ отбора in vitro кислотоустойчивых форм клевера лугового

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Изобретение представляет собой способ отбора in vitro кислотоустойчивых генотипов клевера лугового, включающий культивирование морфогенной культуры клевера лугового на питательной среде Гамборга В, где морфогенную культуру получают путем...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002583304
Дата охранного документа: 10.05.2016
12.01.2017
№217.015.58bd

Ротационная косилка с кондиционирующим устройством

Изобретение относится к сельскохозяйственному машиностроению и может быть использовано в машинах для кормопроизводства. Ротационная косилка с кондиционирующим устройством содержит режущий аппарат с вращающимися дисками с шарнирными ножами и вертикально установленные съемные барабаны 4 с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002588180
Дата охранного документа: 27.06.2016
12.01.2017
№217.015.58d3

Ротационная косилка с кондиционером динамического действия

Изобретение относится к сельскохозяйственному машиностроению и может быть использовано в машинах для кормопроизводства. Ротационная косилка с кондиционером динамического действия содержит режущий аппарат с вращающимися дисками с шарнирными ножами и вертикально установленные барабаны 4 с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002588181
Дата охранного документа: 27.06.2016
12.01.2017
№217.015.5970

Ротационная косилка с ножевым кондиционером

Изобретение относится к сельскохозяйственному машиностроению и может быть использовано в устройствах для кормопроизводства. Ротационная косилка с ножевым кондиционером содержит режущий аппарат с вращающимися дисками с шарнирными ножами и вертикально установленные съемные барабаны с основаниями...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002588183
Дата охранного документа: 27.06.2016
13.01.2017
№217.015.6bc8

Способ отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий rhizobium loti l., способных к эффективному симбиозу с лядвенцем рогатым

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции растений для повышения продуктивности лядвенца рогатого. Способ предусматривает выращивание лядвенца рогатого на питательной среде Красильникова-Кореняко, в которую добавляют минеральный азот в дозе 0,072 г/л....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002592677
Дата охранного документа: 27.07.2016
25.08.2017
№217.015.c41f

Ротационная косилка с аэратором

Изобретение относится к сельскохозяйственному машиностроению и может быть использовано в ротационных косилках для образования рыхлых валков при скашивании естественных и сеяных трав и ускорения их провяливания. Ротационная косилка с аэратором содержит роторы (2) с вертикальными осями вращения,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002617338
Дата охранного документа: 24.04.2017
20.01.2018
№218.016.1317

Способ фитомелиоративного восстановления сильно сбитых и деградированных пастбищных угодий

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может найти применение для улучшения деградированных пастбищ. Способ включает рыхление дернины, подсев трав и полукустарников - улучшателей, обладающих виолентностью и патиентностью: волоснеца гигантского (Elymus giganteas Vahl.), житняков...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002634435
Дата охранного документа: 30.10.2017
Показаны записи 1-10 из 10.
20.04.2016
№216.015.338e

Способ маркирования сортов-популяций люцерны

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Изобретение представляет собой способ маркирования сортов-популяций люцерны, включающий при скрещивании родительских пар удаление верхней части паруса распустившегося цветка, осуществление искусственного триппинга, помещение соцветия в гипотонический...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002582267
Дата охранного документа: 20.04.2016
10.05.2016
№216.015.3cc0

Способ отбора in vitro кислотоустойчивых форм клевера лугового

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Изобретение представляет собой способ отбора in vitro кислотоустойчивых генотипов клевера лугового, включающий культивирование морфогенной культуры клевера лугового на питательной среде Гамборга В, где морфогенную культуру получают путем...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002583304
Дата охранного документа: 10.05.2016
12.01.2017
№217.015.58bd

Ротационная косилка с кондиционирующим устройством

Изобретение относится к сельскохозяйственному машиностроению и может быть использовано в машинах для кормопроизводства. Ротационная косилка с кондиционирующим устройством содержит режущий аппарат с вращающимися дисками с шарнирными ножами и вертикально установленные съемные барабаны 4 с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002588180
Дата охранного документа: 27.06.2016
12.01.2017
№217.015.58d3

Ротационная косилка с кондиционером динамического действия

Изобретение относится к сельскохозяйственному машиностроению и может быть использовано в машинах для кормопроизводства. Ротационная косилка с кондиционером динамического действия содержит режущий аппарат с вращающимися дисками с шарнирными ножами и вертикально установленные барабаны 4 с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002588181
Дата охранного документа: 27.06.2016
12.01.2017
№217.015.5970

Ротационная косилка с ножевым кондиционером

Изобретение относится к сельскохозяйственному машиностроению и может быть использовано в устройствах для кормопроизводства. Ротационная косилка с ножевым кондиционером содержит режущий аппарат с вращающимися дисками с шарнирными ножами и вертикально установленные съемные барабаны с основаниями...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002588183
Дата охранного документа: 27.06.2016
13.01.2017
№217.015.6bc8

Способ отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий rhizobium loti l., способных к эффективному симбиозу с лядвенцем рогатым

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции растений для повышения продуктивности лядвенца рогатого. Способ предусматривает выращивание лядвенца рогатого на питательной среде Красильникова-Кореняко, в которую добавляют минеральный азот в дозе 0,072 г/л....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002592677
Дата охранного документа: 27.07.2016
25.08.2017
№217.015.c41f

Ротационная косилка с аэратором

Изобретение относится к сельскохозяйственному машиностроению и может быть использовано в ротационных косилках для образования рыхлых валков при скашивании естественных и сеяных трав и ускорения их провяливания. Ротационная косилка с аэратором содержит роторы (2) с вертикальными осями вращения,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002617338
Дата охранного документа: 24.04.2017
20.01.2018
№218.016.1317

Способ фитомелиоративного восстановления сильно сбитых и деградированных пастбищных угодий

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может найти применение для улучшения деградированных пастбищ. Способ включает рыхление дернины, подсев трав и полукустарников - улучшателей, обладающих виолентностью и патиентностью: волоснеца гигантского (Elymus giganteas Vahl.), житняков...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002634435
Дата охранного документа: 30.10.2017
15.02.2019
№219.016.bad5

Способ повышения семенной продуктивности люцерны

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ повышения семенной продуктивности люцерны, включающий скрещивание родительских пар с использованием доноров рецессивных генов, контролирующих фенотипический признак - соцветие типа «цветная капуста» с полной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002679837
Дата охранного документа: 13.02.2019
24.01.2020
№220.017.f8e3

Способ отбора in vitro кислотовыносливых форм клевера лугового (trifolium pratense l.)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ отбора in vitro кислотовыносливых форм клевера лугового, включающий культивирование на питательной среде Гамборга В морфогенной культуры клевера лугового, полученной путем проращивания семян и культивирования...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002711781
Дата охранного документа: 22.01.2020
+ добавить свой РИД