СПОСОБ КЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ В АВТОТРОФНЫХ УСЛОВИЯХ НА ГИДРОПОНИКЕ

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к растениеводству, и может быть использовано для клонального размножения растений в автотрофных условиях культивирования на гидропонике.

Клональное микроразмножение широко используется для размножения новых сортов и трансгенных растений, а также для размножения существующих сортов с целью массового получения оздоровленного посадочного материала. Эффективность клонального размножения определяется стабильностью воспроизводства исходного генотипа, скоростью роста и развития растений-регенерантов, а также их способностью адаптироваться к последующим условиям культивирования.

Известен способ клонального микроразмножения растений (Пузанков О.П., Гришанович А.К. и др. Методические указания по оздоровлению семенного картофеля. Минск, Урожай, 1988, с. 29), основанный на активации уже существующих у растения меристем путем снятия апикального доминирования за счет удаления верхушечной части стебля и последующего микрочеренкования in vitro с добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие пазушных побегов. Недостатком способа являются низкие скорости размножения, нестабильное воспроизводство исходного генотипа, длительный адаптационный период при высадке растений в грунт, высокая трудоемкость.

Наиболее близким способом к заявляемому изобретению является способ клонального микроразмножения растений (Патент РФ №2080780, МПК А01Н 4/00, опубл. 10.06.1997 г.), в котором клональное микроразмножение растений осуществляется в культуре in vitro путем микрочеренкования регенерантов и укоренения черенков на питательной среде, в которой в качестве источника углерода для укоренения используют фруктозу или смесь фруктозы с сахарозой.

Недостатком способа является то, что культивирование черенков осуществляют в преимущественно гетеротрофных условиях, что обуславливает существенно более низкие скорости роста и развития растений-регенерантов в сравнение с автотрофными условиями культивирования. Это следует из того, что фотосинтетический рост растений-регенерантов в культуре in vitro ограничен низкой концентрацией СО₂ внутри пробирки, так как поступление углекислого газа из окружающего воздуха через изолирующую от внешней среды пробку незначительно из-за отсутствия достаточной разницы парциальных давлений. Для обеспечения высокой скорости фотосинтетического роста необходимо поступление в пробирку 400 мг (200 мл) СО₂ за световой период, т.е. диффузия через пробку должна быть, по крайней мере, на порядок более интенсивной (Цоглин Л.Н. и др. Газообмен и фотосинтез растений картофеля в условиях in vitro // Доклады Академии Наук СССР, т. 316, №.4, 1991).

Важнейшим условием реализации фотосинтетического роста также является светообеспечение растений. Для фотоавтотрофного роста растений в естественных условиях характерны высокие (150÷200 Вт ФАР/м²) значения интенсивности света. Однако культивирование растений в пробирках при таких уровнях облучения практически невозможно из-за их перегрева в условиях естественного конвективного теплосъема. Поэтому в светокультуре растений культивирование in vitro осуществляют при интенсивностях света не выше 20÷30 Вт ФАР/м².

Таким образом в культуре in vitro имеет место преимущественно гетеротрофный рост растений-регенерантов, для обеспечения которого питательная среда должна содержать достаточное количество углеродсодержащих органических соединений, витаминов, гормонов и микроэлементов. Такие питательные среды являются также хорошим субстратом и для широкого спектра грибов и микроорганизмов, что определяет высокие требования к стерильности культивирования.

Биологически активные компоненты питательных сред способны вызывать генетические изменения в клетках, что приводит к генетической вариабельности получаемых регенерантов. В процессе размножения в культуре in vitro генетические изменения накапливаются, увеличивается количество регенерантов со значительным морфофизиологическим разнообразием и утратой ценных хозяйственных признаков, а также снижением фотосинтетического потенциала (Леонова Н.С. "Использование метода культуры ткани в селекции картофеля". Сибирский вестник с/х науки, 1986, N3, с. 18-26; Grout B.W. et. al. Transplanting of Cauliflower Plants Regenerated from Meristem Culture. Carbon Dioxide Fixation and the Development of Photosynthetic Ability // Hort. Res. 1978. V. 17. №2. P. 65; Sutter E.G. et. al. Morphological Adaptation of Leaves of Strawberry Plants groun in vitro after Removal from Culture // Tissue Cult. Forest. and Agr. Proc. 3-rd Tenn. Symp. Plant Cell and Tissue Cult. Knoxville, Tenn. (9-13 Sept. 1984) N. Y.; L., 1985, p. 358). Причиной этого является не только биологически активные компоненты питательных сред, но и гетеротрофный рост в культуре in vitro и селекция по гетеротрофному признаку в процессе размножения при многократном пассировании растений (оператор отбирает лучшие растения для черенкования, т.е. наилучшим образом адаптированные именно к гетеротрофным условиям роста). Таким образом направленность автоселекционного процесса в популяции идет в сторону, обеспечивающую максиальную реализацию условий роста и развития, которую предоставляет именно гетеротрофный способ культивирования.

В рассматриваемом прототипе разработан способ, предусматривающий снижение отрицательного воздействия компонентов питательных сред на клетки и на стабильность воспроизведения исходного генотипа в процессе клонального микроразмножения растений. Для этого предлагается модифицировать питательную среду путем использования в качестве источника углерода фруктозы в количестве 10000-20000 мг/л или смеси фруктозы и сахарозы в соотношении 0,5-1:1. По сути это является борьбой со следствием, но никак не с причиной, что собственно и подтверждают авторы, претендуя лишь на «увеличение выхода регенерантов с исходным генотипом».

При культивировании растений в культуре in vitro как на жидких, так и на твердых питательных средах аэрация корневой системы существенным образом затруднена, что препятствует нормальному развитию корневой системы растений-регенерантов. Слабо развитые фотосинтетический аппарат и корневая система растений-регенерантов, размноженных в культуре in vitro, обуславливают длительный адаптационный период и плохую приживаемость растений при высадке в грунт или гидропонику (вследствие светового шока, отмирания старой корневой системы и образования новой).

Массовое производство (от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч) растений-регенерантов в культуре in vitro к заданному сроку для высадки в грунт или гидропонику сопряжено со значительными трудозатратами. Трудозатраты определяются, главным образом, множественностью ручных операций по подготовке тысяч пробирок: мытье, сушка, розлив в каждую пробирку заданного количества питательной среды, стерилизация пробирок, пробок и сред, фиксация черенка в пробирке и т.д. В себестоимость пробирочных растений вносит заметный вклад и достаточно высокая стоимость используемых органических питательных сред.

В основу изобретения положена задача, заключающаяся в создании способа клонального размножения растений, в котором при низких трудоемкости и затратах обеспечивается стабильность воспроизводства исходного генотипа, высокая скорость размножения растений-регенерантов, а также способность их к быстрой адаптации при высадке в грунт или гидропонику.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе клонального микроразмножения растений, осуществляемом путем микрочеренкования регенерантов и укоренения черенков на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода фруктозу в количестве 10000-20000 мг/л или смесь фруктозы и сахарозы в соотношении 0,5-1:1, согласно изобретению укоренение черенков производят в гидропонной установке на жидких питательных средах, содержащих только минеральные элементы, путем периодического орошения оснований черенков, а в дальнейшем и корневой системы растений при нормальных либо повышенных концентрация СО₂ в атмосфере и интенсивности облучения посева не менее 60 Вт ФАР/м².

Введение в известный способ совокупности существенных отличительных признаков позволяют реализовать фотоавтотрофные условия для культивирования растений-регенерантов и черенков.

Скорость фотосинтетического роста растений значительно выше гетеротрофного. Адаптированные к условиям роста in vivo (при нормальных или повышенных концентрациях CO₂) растения-регенеранты способны увеличивать свою биомассу на 200 мг в сутки, а при росте in vitro - не более чем на 50 мг (Цоглин Л.Н. и др. Газообмен и фотосинтез растений картофеля в условиях in vitro II Доклады Академии Наук СССР, т. 316, №.4, 1991). В отличие от гетеротрофно выращенных растений, растения-регенеранты, выращенные в фотоавтотрофных условиях, имеют больший вес и большую площадь листовой поверхности, а их фотосинтетический аппарат хорошо развит, что обуславливает отсутствие адаптационного периода и практически 100% приживаемость при высадке в грунт или гидропонику. При клональном микроразмножении автотрофное культивирование растений-регенерантов определяет направленность автоселекционного процесса в популяции в сторону максимальной реализации условий фотосинтетического роста, т.е. в сторону улучшения хозяйственных качеств растений (Цоглин Л.Н., Габель Б.В. Селекционные процессы при гетератрофном и фототрофном микроклональном размножении растений // Доклады Академии Наук РФ, т. 334, №4, с. 533-534, 1994 г.; Tsoglin, L., Gabel, В., Satilo, V. Autoselection during plant micropropagation: potato phototrophic micropropagation in vitro. Conference on "PROGRESS IN PLANT SCIENCES from Plant Breeding to Growth Regulation" (17-19 June 1996), Mosonmagyarovar - Hungary, 1996, p. 11-13).

При автотрофном росте и развитии отпадает необходимость использования органических соединений в питательном растворе. Достаточно лишь обеспечить нелимитированное минеральное питание растений. Отсутствие биологически активных компонентов в питательной среде исключает вероятность генетических изменений в клетках и, соответственно, генетическую вариабельность регенерантов. Использование жидких питательных растворов на минеральной основе позволяет радикально снизить требования к стерильности условий культивирования. Это, в свою очередь, позволяет отказаться от необходимости размещения каждого черенка в изолированном от внешней среды объеме (пробирке), существенно упростить технологические процессы и снизить трудозатраты. Кроме этого использование жидких питательных растворов позволяет с помощью простых технических решений обеспечить эффективную аэрацию корневой системы растений и реализовать размножение растений на промышленной основе в гидропонных установках (Патент РФ №2049384, МПК A01G 31/02, опубл. 10.12.1995 г.,), существенно снизив при этом себестоимость растений в сравнение с традиционной технологией культивирования in vitro.

Предлагаемый способ клонального размножения растений е автотрофных условиях на гидропонике реализуется следующим образом. Черенкование исходных растений проводят в ламинар-боксе. Удаляют верхушечную меристему стебля и затем черенкуют побег в соответствии с количеством междоузлий таким образом, чтобы на каждом черенке остался один лист, а длина стебля ниже пазушной почки составляла 0.5-1.0 см. Черенки высаживают вдоль кассеты (Авторское свидетельство СССР №1287795, МПК A01G 31/02, опубл. 08.10.1986 г.) между ее вертикальными стенками и упругим вкладышем в шахматном порядке с шагом вдоль каждой 7

стороны, например, для картофеля и стевии 4 см, а для топинамбура - 5 см. При этом основание черенка заглубляют в кассету так, чтобы пазушная почка располагалась на уровне сопряжения упругого вкладыша со стенкой кассеты. Затем кассету с черенками размещают в вегетационной ванне гидропонной установки (Патент РФ на промышленный образец №42795, опуб. 16.09.1996 г.), которая периодически заполняется питательным раствором до уровня сопряжения упругого вкладыша со стенкой кассеты. В паузах между подтоплениями происходит аэрация корневой системы растений. Гидропонную установку размещают в чистом помещение, удовлетворяющем фитосанитарным требованиям. Культивирование растений в установке осуществляют до образования 4-0 междоузлей, например, для картофеля, стевии и тапинабура - 14-18 суток (в культуре in vitro - 27-34 дня). Затем растения можно опять отчеренковать и, высадив черенки в кассету, продолжить размножение в установке. Размноженные таким образом растения высаживают в грунт. В процессе размножения растений поддерживают следующие параметры культивирования: интенсивность облучения посева не менее 60 Вт ФАР/м²; концентрация СО₂ в посеве - 0,04 до 0,4%; фотопериод - 16÷48 час./сут.; время наполнения ванны раствором - 5 мин, время аэрации корневой системы - 20 мин.; температура воздуха в режиме «День» - 21-23°С; температура воздуха в режиме «Ночь» -18-20°С; температура питательного раствора в баке 16-20°С; относительная влажность воздуха в помещение - 75-85% (круглосуточно).

Композицию питательного раствора для каждого вида растений подбирают в соответствие с характерным для них выносом минеральных макро- и микроэлементов. Например, для картофеля это питательный раствор на основе среды Пилгремма с половинной концентрацией состава минеральных элементов, а для стевии и топинамбура питательный раствор на основе среды Кнопа.

8

Клональное размножение в автотрофных условиях культивирования в сравнение с размножением в гетеротрофных условиях обладает следующими преимуществами:

- более высокой скоростью роста и развития растений и, соответственно, большей скоростью размножения;

- направленностью автоселекционных процессов в сторону отбора растений с лучшими фотосинтетическими свойствами;

- надежностью воспроизводства исходного генотипа растений;

- практически 100% приживаемостью растений при высадке в грунт или гидропонику и отсутствием адаптационного периода;

- использованием простых жидких питательных сред без органических соединений;

- существенно более низкими требованием к стерильности процессов микрочеренкования и культивирования;

- низкими затратами на питательные среды

- низкой трудоемкостью.