СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РЕПРОДУКТИВНЫХ НАРУШЕНИЙ У ЖЕНЩИН С ИЗБЫТОЧНОЙ МАССОЙ ТЕЛА И ОЖИРЕНИЕМ

Изобретение относится к клинической медицине, в частности к специальности акушерство и гинекология, и касается поиска новых возможностей прогнозирования репродуктивных нарушений у женщин с избыточной массой тела и ожирением.

В результате проведенного патентного поиска был найден способ прогнозирования развития репродуктивных нарушений /1/. Сущность способа состоит в том, что в околоплодных водах женщин в 16-20 недель беременности определяют ДНК-связывающую активность транскрипционного ядерного фактора (NF-kB) и при ее значении от 2,9 до 3,7 ед/мг белка диагностируют компенсированную плацентарную недостаточность, а при значении 2,8 ед/мг белка и ниже диагностируют декомпенсированную плацентарную недостаточность.

Недостатком способа является то, что

1. Определяется NF-kB в околоплодных водах, что является инвазивной методикой, которая имеет достаточно большое количество осложнений, вплоть до прерывания беременности.

2. Прогнозируется риск развития плацентарной недостаточности уже у беременных женщин и не представляется возможным оценка риска и коррекция на этапе прегравидарной подготовки (до наступления беременности).

Известно исследование оценки роли NF-kB в формировании плацентарной недостаточности /3/. Недостатком этого исследования является то, что в связи с проведением исследования в плаценте после родов установить прогностические критерии NF-kB невозможно.

Задача изобретения - обеспечение возможности прогнозирования репродуктивных нарушений у женщин с избыточной массой тела и ожирением в период подготовки к беременности.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что раннее прогнозирование достигается за счет определения активности NF-kB в аспирате из полости матки, поскольку он является одним из ключевых транскрипционных факторов, с фундаментальными клеточными процессами, модулирует экспрессию более чем 150 генов, вовлеченных в процессы апоптоза, ангиогенеза, дифференцировки и пролиферации и, соответственно, является информативным маркером при прогнозировании репродуктивных нарушений /2, 4, 5, 6, 7/.

Изобретение иллюстрируется фиг. 1 - ROC - кривая NF-kB в аспирате из полости матки.

Предлагаемый способ осуществлялся следующим образом. Для прогнозирования репродуктивных нарушений проводился забор содержимого из полсти матки с помощью мануальной вакуумной аспирации на 21 день менструального цикла.

Материал из полости матки получали посредством введения в полость матки через цервикальный канал катетера 2-4 мм и производили аспирацию ее содержимого посредствам шприца. После извлечения катетера из матки содержимое помещали в пробирку.

Для получения экстрактов аспират, полученный из полости матки, смешивали с физиологическим раствором в объеме 1 мл и центрифугировали при 4000g при температуре +4°С. Супернатант отбрасывали, клеточную взвесь растирали пестиком в фарфоровой ступке и гомогенизировали до однородной массы. К полученному гомогенату добавляли физиологический раствор в объеме 1:1 и получали клеточный экстракт. Клеточный экстракт помещали в пластиковые пробирки Falcon и подвергали замораживанию при -20°С в течение суток. Затем клеточный экстракт размораживали и центрифугировали при 4000g при температуре +4°С. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при -20°С до проведения ИФА. Активность NF-kB определялась с помощью наборов «Саутап» (США), согласно протоколам для постановки ИФА от фирмы-производителя.

Принцип, лежащий в основе данных тест-систем, заключается в том, что специфичные антитела были сорбированы в ячейках планшета. При добавлении контрольных образцов сыворотки крови происходит связывание с антителами в ячейках планшета с образованием ферментного комплекса. Несвязанные материалы удаляются при отмывке, после которой добавляется субстратный раствор, взаимодействующий с ферментным комплексом с образованием окрашенного раствора. Регистрацию результатов ИФА проводили на аппарате ридер «Stat-Fax 2100» (США) при длине волны 450 нм, длина сравнения 620 нм. Интенсивность окраски, измеренная при указанной длине волны, была прямо пропорциональна содержанию концентрации определяемых антител, иммуноглобулинов, цитокинов и гормонов в образцах.

При неблагоприятном прогнозе на беременность - NF-kB>6,86 пг/мл; при неблагоприятном прогнозе на вынашивание беременности - NF-kB - 5,21-6,86 пг/мл; при благоприятном - NF-kB 4,93-5,20 пг/мл.

Этот способ позволяет заблаговременно выявить нарушения репродуктивной функции и своевременно провести коррекцию на прегравидарном этапе (на этапе подготовки к беременности). Также предложенный способ обеспечивает возможность скринингового обследования пациенток с избыточной массой тела и ожирением, а именно прогнозировать репродуктивные нарушения, своевременно проводить коррекцию на прегравидарном этапе (на этапе подготовки к беременности), что позволит предупредить репродуктивные потери, ускорить реализацию генеративной функции и уменьшить материальные затраты на терапию, направленную на сохранение беременности и лечение осложнений.

Новыми признаками заявленного способа являются:

- прогнозирование репродуктивных нарушений на этапе прегравидарной подготовки;

- оценка NF-kB в аспирате из полости матки;

- в качестве биологического материала используется аспират из полости матки (из места непосредственной имплантации эмбриона);

- прогнозируют развитие репродуктивных нарушений у пациенток с избыточной массой тела и ожирением, при неблагоприятном прогнозе на беременность - NF-kB>6,86 пг/мл; при неблагоприятном прогнозе на вынашивание беременности - NF-kB - 5,21-6,86 пг/мл; при благоприятном - NF-kB 4,93-5,20 пг/мл.

В основу предлагаемого способа положено новое знание, полученное в результате лабораторного исследования изменения активности NF-kB в аспирате из полости матки как фактора, стимулирующего экспрессию провоспалительных цитокинов, хемокинов и других молекул воспаления, ингибирующих передачу инсулинового сигнала, что приводит к инсулинорезистентности, у женщин репродуктивного возраста с избыточной массой тела (25-29,9 кг/м² - средняя масса тела составила 24,7±0,43 кг/м²) и ожирением (30,0-40 и более кг/м² - средняя масса тела составила 31,3±0,53 кг/м²) по сравнению с женщинами, имеющими нормальную массу тела (18,0-24,9 кг/м² - средняя масса тела составила 21,75±0,28 кг/м) - условно здоровые.

Автор впервые обнаружил, что у женщин с избыточной массой тела и ожирением в аспирате из полости матки повышается активность NF-kB.

Исследование проведено у 68 женщин репродуктивного возраста с избыточной массой (n=26) тела и ожирением (n=42) и у 24 условно здоровых женщин, на базе гинекологических отделений ГАУЗ ГКБ и ГАУЗ АОКБ. Забор аспирата проводился на 21 день менструального цикла с целью определения активности NF-kB в секреторную фазу менструального цикла (фазу имплантации).

У пациенток с избыточной массой тела и ожирением (у 51 обследуемой) в аспирате из полости матки было определено повышение активности NF-kB. В последующем у 32 пациенток развилось бесплодие, у 13 произошел самопроизвольный аборт. Репродуктивные нарушения у данных пациенток имеют эндокринный характер и связаны с развитием избыточной массы тела и ожирения.

Для проведения сравнительного анализа эффективности диагностических показателей использовался Receiver Operator Characteristic (ROC) - анализ. ROC - анализ используется для определения оптимального значения величины порога отсечения, площади под кривой (AUC).

При проведении анализа эффективности показателя NF-kB в аспирате из полости матки для данного заболевания получили площадь под кривой AUC NF-kB=0,89 (чувствительность - 95%, специфичность - 90%, Фиг. 1), что говорит об отличной клинической значимости NF-kB.

Пример 1

Пациентка А. 24 года, планирует беременность.

Жалобы на момент обследования: на резкую прибавку массы тела в течение года на 6 кг и отсутствие беременности в течение 2 лет.

В анамнезе: менструации с 12 лет, по 4 дня, через 30 дней, с 16 лет - по 30-60 дней, нерегулярные. В 14 лет отмечает прибавку массы тела, была обследована, получала лечение у эндокринолога. В репродуктивном возрасте не обследована, лечение не получала.

Беременности не было.

Контрацепция - барьерная. В течение последних 2 лет не предохранялась.

Объективно: ИМТ 28,3 кг/м², стрии перламутрового цвета в области бедер и ягодиц, стрии бордового цвета в области груди и бедер.

Клинический диагноз: Бесплодие 1. Избыточная масса тела.

Проведено обследование: содержание в аспирате из полости матки NF-kB - 7,11 пг/мл. Определен неблагоприятный прогноз на беременность. Пациентка оставлена на курации. Проведена патогенетическая терапия в течение 6 месяцев и стандартная прегравидарная подготовка по окончании лечения (согласно приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.11.2012 г. №572 н «к Порядку оказания медицинской помощи по профилю «акушерство и гинекология (за исключением использования ВРТ)».

Через 9 месяцев наступила беременность с благоприятным исходом - рождением доношенного ребенка.

Пример 2

Пациентка В. 24 года, планирует беременность.

Жалобы на момент обследования: не предъявляет.

В анамнезе: менструации с 11 лет, по 4-5 дней, через 30 дней, с 14 лет отмечает прибавку массы тела и задержку менструации до 6 месяцев, получала лечение у гинеколога и эндокринолога.

В репродуктивном возрасте не обследована, лечение не получала.

Беременностей не было.

Контрацепция - комбинированными оральными контрацептивами (3 года).

Объективно: ИМТ 26,8 кг/м², стрии перламутрового цвета в области бедер и ягодиц.

Клинический диагноз: Прегравидарная подготовка. Избыточная масса тела.

Пациентке рекомендована отмена комбинированных оральных контрацептивов, явка через 3 месяца.

Проведено обследование: содержание в аспирате из полости матки NF-kB 4,98 пг/мл. Определен благоприятный прогноз на беременность.

Пациентке назначена прегравидарная подготовка согласно приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.11.2012 г. №572 н «к Порядку оказания медицинской помощи по профилю «акушерство и гинекология (за исключением использования ВРТ)».

Беременность наступила через 4 месяца с благоприятным исходом - рождение живого доношенного ребенка.

Пример 3

Пациентка В. 27 лет, планирует беременность.

Жалобы на момент обследования: на резкую прибавку массы тела (на 8 кг за 6 месяцев) и задержку менструации на 3 месяца.

В анамнезе: менструации с 12 лет, по 4-5 дней, через 30-45 дней, нерегулярные. Отмечает прибавку массы тела с пубертатного периода, лечение не получала. Больной себя не считает. У матери и бабушки имеется ожирение 2 степени.

Беременности не было.

Контрацепцию не использует.

Объективно: ИМТ 34,4 кг/м², стрии перламутрового и бордового цвета в области бедер и ягодиц.

Клинический диагноз: Бесплодие 1. Ожирение 1 степени. Олигоменорея.

Проведено обследование содержание в аспирате из полости матки NF-kB>7,93 пг/мл. Определен неблагоприятный прогноз на беременность.

Пациентка оставлена на курации. Проведено патогенетическое лечение в течение 6 месяцев совместно с эндокринологом.

При повторной явке через 9 месяцев. Объективно: ИМТ 31,9 кг/м², менструации последние 3 месяца регулярные.

Клинический диагноз: Бесплодие 1. Ожирение 1 степени.

Проведено обследование содержание в аспирате из полости матки NF-kB - 6,14 пг/мл. Определен неблагоприятный прогноз на вынашивание беременности. Пациентке рекомендовано было продолжить патогнетическую терапию в течение 3 месяцев. Женщина отказалась от проведения дальнейшего лечения. Пациентке назначена стандартная прегравидарная подготовка. Об осложнениях, которые могут возникнуть во время беременности, предупреждена.

Беременность наступила через 3 месяца. Беременность осложнилась в первом триместре - начавшимся самопроизвольным абортом на сроке 6-7 и 16-17 недель, что потребовало госпитализации в стационар, во втором - гестационным сахарным диабетом (коррекция диетой). Исход беременности - благоприятный, рождение доношенного ребенка.

Данный способ прогнозирования репродуктивных нарушений является современным, объективным, легковоспроизводимым, малотравматичным способом получения содержимого из полости матки, имеющим высокую чувствительность и специфичность с использованием сравнительного нового маркера для клинической практики, модулирующего процессы апоптоза, ангиогенеза, дифференцировки и пролиферации.

Технический результат

При обследовании пациенток в репродуктивном возрасте с избыточной массой тела и ожирением на этапе прегравидарной подготовки (до наступления беременности) можно своевременно определить репродуктивный прогноз и провести коррекцию нарушений, что позволит предупредить репродуктивные потери, ускорить реализацию генеративной функции и уменьшить материальные затраты на терапию, направленную на сохранение беременности и лечение осложнений.

Литература

1. Патент РФ №2463595, опубликован 10.10.2012, «Способ диагностики плацентарной недостаточности».

2. Гунько В.О., Погорелова Т.В., Линде В.А. Участие фактора NF-kB и его регуляторных белков в развитии осложнений беременности // Пробл. репрод. - 2013. - №2. - С. 88-91.

3. Жуковец И.В., Целуйко С.С. Роль NF-kB и цитокинов в формировании плацентарной недостаточности у женщин с ожирением на фоне дисфункции гипоталамуса // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2015. - выпуск 56. - С. 62-66.

4. Кайдашев И.П. Активация ядерного фактора как молекулярной основы патогенеза метаболического синдрома // Патол. физиол. и эксперимент, терапия. - 2013. - №3. - С. 65-72.

5. Шварц В. Физиологическая и патологическая роль рецепторов врожденной иммунной системы жировой ткани // Патол. физиол. и эксперимент. терапия. - 2010. - №3. - С. 45-51.

6. Glass С.K., Saijo K. Nuclear receptor transrepression pathways that regulate inflammation in macrophages and T cells // Nat. Rev. Immunol. - 2010. - Vol. 10, №5. - P. 365-376.

7. Murphy A.J., Guyre P.M., Pioli P.A. Estradiolsuppresses NF-kappa В activation through coordinated regulation of let-7a and miR-125b in primary human macrophages // J. Immunol. - 2010. - Vol. 184, №9. - P. 5029-37