Результат интеллектуальной деятельности: ПРИМЕНЕНИЕ (1S,3aR,4R,7aS)-N-(2,2,4,7a-ТЕТРАМЕТИЛОКТАГИДРО-1,4-ЭТАНОИНДЕН-3а-ИЛ)-АЦЕТАМИДА В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРА РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ГРИППА

Изобретение относится к химии и медицине, а именно к лекарственным средствам, конкретно, к известному соединению (1S,3aR,4R,7aS)-N-(2,2,4,7a-тетраметилоктагидро-1,4-этаноинден-3а-ил)-ацетамиду формулы I (включая его пространственные изомеры, в том числе оптически активные формы):

у которого выявлена биологическая активность, заключающаяся в ингибировании репродукции вируса гриппа.

Грипп - острое инфекционное заболевание дыхательных путей, вызываемое РНК-содержащим вирусом, имеющим высокую эпидемиологическую и клиническую значимость с высокой частотой осложнений среди лиц повышенного уровня риска.

Вирусы гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) вызывают массовые вспышки заболеваний, принимающие почти ежегодно характер эпидемий. Ежегодно регистрируется от 27 до 41 млн случаев этих заболеваний, в частности гриппом переболевает от 5 до 15% населения России в год. Грипп и ОРВИ остаются практически неконтролируемыми заболеваниями из-за высокой изменчивости антигенной структуры циркулирующих вирусов гриппа и гетерогенности возбудителей ОРВИ. Кроме того, вирусы гриппа и других ОРВИ способны изменять свои свойства и патогенность. Последним примером таких изменений является возбудитель гриппа H1N1pdm09, циркулирующий в эпидемический сезон 2009-2010 гг., получивший название «свиной грипп», этот же штамм вируса вызвал эпидемию в сезон 2015-2016 гг.

Противовирусные средства для лечения гриппа представляют собой крайне ограниченную группу лекарственных препаратов, причем для большинства из них известна резистентность к ним вирусов. Создание противовирусных препаратов - это ближайшая перспектива развития медицинской науки в области создания средств лечения и профилактики вирусных инфекций [Еропкин М.Ю., Зарубаев В.В. Современное состояние разработок новых антивирусных препаратов против гриппа и ОРВИ // Фармацевтический бюллетень. - 2012. №1. - С 68]. Благодаря особенностям организации генома (отсутствие механизма коррекции ошибок репликации) и короткому жизненному циклу вирус гриппа обладает высокой скоростью мутаций. Как результат, антигенная структура вируса в высокой степени подвержена изменениям в результате селективного давления иммунной системы организма-хозяина. Кроме того, применение химиопрепаратов воспринимается вирусом как фактор селекции, в результате чего также происходит формирование устойчивых штаммов. Эти два процесса приводят к появлению вариантов вирусов, способных избегать как активности нейтрализующих антител, и тем самым ускользать от иммунного ответа организма, так и преодолевать действие химиопрепаратов, направленных на определенный этап репродукции вируса. При этом каждый тип вируса имеет свой механизм приспособления к химическому препарату [Ison M.G. Antivirals and resistance: influenza virus // Current Opinion in Virology - 2011, - V 1. P. 563-573].

Известны ингибиторы нейраминидазы, зарегистрированные в России: Озельтамивир (Тамифлю) и Занамивир (Реленза), а также используемые в США: Перамивир (Рапиакта) и Ланинамивир (Инавир), которые действуют на этапе почкования вновь синтезированных вирионов гриппа из оболочки клетки, блокируя отщепление частиц вирусного потомства от поверхности клеток [Ison M.G. Clinical use of approved influenza antivirals: therapy and prophylaxis. // Influenza Other Respi Viruses. 2013;7 Suppl 1: 7-13]. Кроме того, ингибиторы вирусной нейраминидазы препятствуют доступу вирионов к клеткам-мишеням, блокируя нейраминидазное расщепление мукополисахаридов слизи верхних дыхательных путей. Практика применения ингибиторов нейраминидазы в лечении гриппа показала, что высокая эффективность этой группы препаратов ограничена ранней стадией заболевания.

Известны также противогриппозные препараты другого механизма действия, например препарат Ремантадин (α-метил-1-адамантилметиламина гидрохлорид) и Амантадин (1-аминоадамантан) [Davies, W.L.; Grunert, R.R.; Haff, R.F.; McGahen, J.W.; Neumayer, E.M; Paulshock, M.; Watts, J.C; Wood, T.R.; Hermann, E.C; Hoffmann, С.E. Antiviral Activity of 1-Adamantanamine (Amantadine) // Science. - 1964. - V. 144. P. 862]. Данные соединения блокируют белок М2 вируса гриппа, препятствуя тем самым процессу расщепления гемагглютинина, слиянию мембран вируса и лизосомальной вакуоли и процессу «раздевания» вируса [Scholtissek С., Quack G., Klenk H.D., Webster R.G. // Antiviral Res. 1998, V. 37, P. 83-95]. Механизм действия этих препаратов изучен достаточно полно [Cady S.D., Schmidt-Rohr K., Wang J., Soto C.S., DeGrado W.F., Hong M.H. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers // Nature. 2010. Vol. 463. P. 689-692]. Адамантановые препараты значительно дешевле и проще в производстве, чем коммерчески доступные ингибиторы нейраминидазы, что делает их более доступными для лечения и профилактики гриппа среди населения. Однако в настоящее время в результате широкого использования адамантановых препаратов значительно утрачены их противовирусные свойства в отношении вирусов гриппа A. Тем не менее каркасные соединения остаются привлекательными в качестве основы для дизайна противовирусных препаратов. Так, известно средство на основе дейтифорина (2-(1'-аминоэтил)бицикло[2.2.1]гептана, являющееся одним из наиболее интересных препаратов на основе природных бициклических каркасных соединений - борнанов [Патент RU 2448692 С2, оп. 27.04.2012].

Наиболее близким к заявляемому соединению прототипом является римантадин, представляющий собой гидрохлорид метилтрицикло[3.3.1.1/.7]декан-1-метанамина формулы II.

Недостатком известного соединения является невысокая противовирусная активность, вызванная резистентностью подавляющего большинства штаммов гриппа к этому препарату.

Задачей изобретения является выявление нового эффективного ингибитора репродукции вируса гриппа, которое может быть синтезировано из доступных реагентов.

Технический результат: повышение эффективности подавления репродукции вируса гриппа и расширение ассортимента ингибиторов репродукции вируса гриппа для преодоления лекарственной устойчивости современных вирусных штаммов.

Поставленная задача решается применением известного соединения, представляющего собой (1S,3aR,4R,7аS)-N-(2,2,4,7а-тетраметилоктагидро-1,4-этаноинден-3а-ил)-ацетамида I (включая его пространственные изомеры, в том числе оптически активные формы):

у которого выявлена новая биологическая активность, заключающаяся в ингибирующем действии на репродукцию вируса гриппа.

Соединение I описано в работе [О.И. Яровая, Д.В. Корчагина, Т.В. Рыбалова, Ю.В. Гатилов, М.П. Половинка, В.А.Бархаш. Взаимодействие кариофиллена, изокариофиллена и их эпоксипроизводных с ацетонитрилом в условиях реакции Риттера \\ ЖОрХ 2004, 40, 11, 1641-1646].

Предлагаемое соединение может быть получено следующим образом:

В качестве исходного для синтеза целевого соединения I используют изокариофиллен. Было показано, что растворение изокариофиллена в системе ацетонитрил-серная кислота, с последующей обработкой водным раствором углекислого натрия приводит к образованию в качестве основного продукта оптически активного соединения (I). Структура полученного соединения была установлена методом рентгеноструктурного анализа. Реакция идет с достаточно хорошим выходом, выделение целевого соединения I происходит путем выкристаллизации из растворителя, для очистки целевого соединения достаточно провести промывку гексаном.

Изокариофиллен - природный сесквитерпеноид, обнаруженный во многих эфирных маслах и коре лиственницы, является устойчивым цис-изомером кариофиллена - более распространенного в природе сесквитерпенового углеводорода. Кариофиллен обнаружен во многих эфирных маслах: бутонов и стеблей гвоздики, бальзама копаиба, цейлонской корицы, западно-индийского сандалового дерева, котовника (14%), а также лаванды, чабреца, перца, пименты. Кариофиллен получают как побочный продукт при выделении эвгенола из гвоздичного масла, изокариофиллен получают изомеризацией кариофиллена.

Остов соединения I совпадает с остовом природного спирта гинсенола, выделенного из корня женьшеня Panax ginseng (Iwabuchi, Н.; Yoshikura, М.; Kamisako, W. Studies on the sesquiterpenoids of Panax ginseng C.A. Meyer. II. Isolation and structure determination of ginsenol, a novel sesquiterpene alcohol Chem. Pharm. Bull. 1988, 36, 2447).

Исследования биологической активности соединения I, проведенные в отношении вируса гриппа, показали крайне высокую эффективность данного вещества как ингибитора репродукции этого вируса.

Полученные количественные показатели ингибирования подтверждают высокую активность при подавлении репликации вируса гриппа в культуре клеток MDCK соединением I, превышающую тот же показатель у эталонов сравнения - амантадина и ремантадина в 120 и более раз. Использование в качестве препаратов сравнения адамантановых производных обусловлено сходством структур: наличием каркасных структурных фрагментов как в соединении I, так и в эталонах сравнения.

Для соединения I проведено изучение токсичности in vivo. Было показано, что LD50 соединения I превышает 5000 мг/кг веса, что подтверждает низкую токсичность данных соединений.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1.

Получение 1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-илиден-аминоэтанола.

Превращение изокариофиллена в системе ацетонитрил-серная кислота. К раствору 0.5 г изокариофиллена в 10 мл ацетонитрила при перемешивании добавляли 0.2 мл серной кислоты, перемешивали 5 мин, реакционную смесь нейтрализовали насыщенным раствором Na₂CO₃. Из органического слоя при стоянии выпадают белые игольчатые кристаллы соединения (I) (т.пл. 213-214°C). Продукт реакции отфильтровали, промыли гексаном, масса выкристаллизовавшегося соединения (I) 0.38 г, масса органического экстракта, содержащего, по данным ГХ/МС, 71% амида (I) - 0.18 г.

(IS,3aR,4R,7aS)-N-(2,2,4,7а-тетраметилоктагидро-1,4-этаноинден-3а-ил)-ацетамид (I). Спектр ЯМР ¹Н (δ, м. д., J, Гц): 0.80 с (С¹²Н₃), 1.03 с и 1.19 с (С¹³Н₃, C¹⁴Н₃), 1.10 с (С¹⁵Н₃), 1.12 м (Н¹¹), 1.24-1.35 м (2Н, H², H⁹), 1.37 д.д (Н⁴, J_4,3'3.5, J_4,3 2.5), 1.41-1.64 м (4Н, Н¹, H³, H^11', H^2'), 1.75-1.93 м (3Н, H^10', H^9', H^3'), 1.94 с (С¹⁸Н₃), 2.28 д и 2.36 д (2H⁶, J_6,6'15) - система АВ, 5.45 ш.с (H¹⁶). Спектр ЯМР ¹³С (δ, м. д.): 40.15 с (С¹), 33.62 т (С²), 25.86 т (С³), 56.08 д (С⁴), 36.41 с (С⁵), 45.05 т (С⁶), 68.07 с (С⁷), 45.83 с (C⁸), 33.68 т (С⁹), 21.43 т (С¹⁰), 34.88 т (С¹¹), 26.85 к (С¹²), 28.16 к и 34.07 к (С¹³, С¹⁴), 30.52 к (С¹⁵), 169.48 с (С¹⁷), 24.26 к (С¹⁸). Элементный состав. Найдено, m/z: 263.22516 [М]⁺. C₁₇H₂₉NO. Вычислено: 263.22490. ИК-спектр ν (ССl₄, см^-1): 1670.1 (С=O), 3440.8 (N-H).

Пример 2.

Изучение токсичности заявленного соединения I.

Токсичность агентов была изучена в отношении клеток MDCK. Клетки MDCK сеяли в 96-луночные планшеты и культивировали при 37°C в среде MEM с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота в атмосфере 5% CO₂ (в газопроточном инкубаторе Sanyo-175) до состояния монослоя. Из исследуемого соединения готовили маточный раствор концентрации 10 мг/мл в диметилсульфоксиде, после чего готовили серию двукратных разведений препаратов в среде MEM от 1000 до 3,75 мг/мл. Растворенный препарат вносили в лунки планшетов и инкубировали 2 суток при 37°C. По истечении этого срока клетки промывали 2 раза по 5 минут фосфатно-солевым буфером, и количество живых клеток оценивали при помощи микротетразолиевого теста (МТТ). С этой целью в лунки планшетов добавляли по 100 мкл раствора (5 мг/мл) 3-(4,5-диметилтиазолил-2) 2,5-дифенилтетразолия бромида (ICN Biochemicals Inc., Aurora, Ohio) на физиологическом растворе. Клетки инкубировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 2 часов и промывали 5 минут фосфатно-солевым буфером. Осадок растворяли в 100 мкл на лунку ДМСО, после чего оптическую плотность в лунках планшетов измеряли на многофункциональном ридере Victor 1420 (Perkin Elmer, Finland) при длине волны 535 нм. По результатам теста для каждого продукта определяли 50% цитотоксическую дозу (CTD₅₀), т.е. концентрацию соединения, вызывающую гибель 50% клеток в культуре. Результаты приведены в таблице.

Пример 3.

Изучение противовирусной активности препаратов на двух типах вирусов.

Определение противовирусной активности препарата проводили на клетках MDCK в 96-луночных планшетах для клеточных культур. Соединение растворяли в поддерживающей среде для клеток, вносили в лунки панелей с клеточным монослоем и инкубировали в течение 1 часа при 36°C в атмосфере 5% CO₂.

Из вируссодержащей жидкости (штаммы A/Califprnia/07/09 (H1N1)pdm09 и A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)) готовили серию десятикратных разведении от 10^-1 до 10^-7, добавляли в лунки с препаратами и инкубировали при 36°C в течение 48 часов в атмосфере 5% CO₂. По окончании срока инкубации 100 мкл культуральной жидкости смешивали с равным объемом 1% куриных эритроцитов в отдельных планшетах с круглым дном. Учет результатов проводили через 60 минут инкубации при 20°C. За титр вируса принимали величину, обратную десятичному логарифму наибольшего разведения исходного вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации в лунке, и выражали в количестве 50% инфекционных доз (ID₅₀). Вирусингибирующее действие исследуемых соединений оценивали по снижению титра вируса в опыте по сравнению с контролем. На основании полученных данных рассчитывали 50% ингибирующую дозу ED₅₀, то есть концентрацию препарата, снижающую уровень вирусной репликации вдвое (на 0,3 lg ID₅₀), и химиотерапевтический индекс, или индекс селективности (SI), представляющий собой отношение CTD₅₀ к ED₅₀.

В процессе исследования ингибирования репродукции вируса гриппа соединением I и эталонами сравнения (амантадином, ремантадином и дейтифорином) были получены результаты, приведенные в таблице.

Из таблицы видно, что соединение I проявляет выраженную противовирусную активность наряду с низкой токсичностью. Химиотерапевтический индекс соединения I значительно превышает таковой у препаратов сравнения. Преимуществом данного соединения является его активность в отношении ремантадин-устойчивого штамма вируса гриппа A/California/07/09 (HlN1)pdm09, что свидетельствует о перспективности применения его для терапии современных эпидемически актуальных вирусов, подавляющее большинство которых устойчивы к ремантадину.

Пример 4.

Исследования острой токсичности соединения выполнены на аутбредных мышах стока CD-I СПФ статуса. Исследуемое вещество в дозах 5000 мг/кг (6 мышей), 1000 мг/кг (6 мышей), 500 мг/кг (6 мышей) вводили в объеме 1 мл внутрижелудочно однократно в виде суспензии, носителем являлся водный 0,5% раствор карбоксиметилцеллюлозы. Во всех группах, получавших вещество, гибели животных не зафиксировано. В группе, получавшей максимальную дозу, погибло 1 животное. Таким образом, по результатам исследования можно говорить о том, что максимально переносимая доза составляет не менее 5000 мг/кг, a LD₅₀ превышает 5000 мг/кг (per os, мыши, самки).