Способ снижения численности бактерий-оппортунистов в средах выращивания личинок морских рыб и их кормов

Изобретение относится к марикультуре, может быть использовано на рыбоводных предприятиях и предназначено для повышения качества среды выращивания кормовых организмов и рыб.

Одна из самых актуальных проблем в технологии выращивания морских рыб - непредсказуемая массовая смертность личинок на ранних стадиях развития, обусловленная вспышками бактериальных инфекций. Особенно чувствительны к инфекциям личинки камбалообразных, так как на ранних стадиях развития их иммунная и пищеварительная система развиты слабо. Выживаемость, рост и развитие искусственно выращиваемых личинок камбалообразных в значительной степени зависят от микробиологических условий в течение эмбрионального развития и на стадии кормления личинок живыми кормами. В связи с этим данное изобретение тестировалось именно в рамках технологической схемы выращивания черноморского калкана.

Известен способ культивирования морских гидробионтов в выростных емкостях, замкнутых в общую автоматизированную систему. Перед подачей воды в бассейны с животными вода проходит фильтрацию и обработку озоном (Automated closed recirculating aquaculture filtration system and method US 5961831 A). Данный способ эффективно элиминирует бактерии и позволяет отказаться от антибиотиков. Однако этот метод имеет ряд недостатков. Во-первых, в некоторых случаях автоматическая очистка воды может быть причиной травматизации организмов, в частности икры. Во-вторых, бактерицидное действие озона обусловлено тем, что он образует с компонентами морской воды окисляющие соединения, которые разрушают оболочку бактерий. Образующиеся соединения могут также вступать в реакцию с оболочкой икры - хорионом, нарушая его биохимическую структуру и изменяя функциональные свойства. Поэтому, несмотря на высокую бактерицидную эффективность озона, его применение должно быть строго регламентировано. Кроме того, как показали наши исследования, разовая обработка среды инкубации икры озоном приводит к массовому неселективному снижению численности бактерий, и в отсутствие постоянного озонирования после непродолжительной лаг-фазы в среде наблюдается вспышка численности быстро растущей оппортунистической микрофлоры. Кроме того, наши исследования также показали, что озонированная вода (при уровне концентрации озона в пределах биологической толерантности дезинфицируемых организмов) недостаточно эффективно элиминирует бактерии, прикрепленные к поверхности организмов.

Известен способ искусственного разведения черноморского калкана, включающий в себя инкубацию икры в инкубаторах, перенос личинок после выклева в выростные бассейны, их обеспечение специально подготовленными живыми кормами. В данном способе очистку воды и водообмен в инкубаторах осуществляют путем использования биофильтра и замкнутой системы циркуляции воды, а обеззараживание производят за счет внесения антибиотиков (Пат. 847961, МПК A01K 61/00, СССР). Этот способ, с технической точки зрения, целесообразен. Однако обеззараживание воды с помощью внесения антибактериальных препаратов не решает проблемы бактериальных контаминаций, поскольку бактерии могут приобретать резистентность к используемым антибиотикам, нарушается сбалансированное микробиологическое сообщество среды, антибиотики накапливаются в культивируемых организмах и могут загрязнять окружающую среду. Негативные аспекты применения антибиотиков обусловливают альтернативные решения проблемы бактериальных контаминаций сред выращивания аквакультурных организмов.

Задачей способа снижения численности бактерий-оппортунистов в средах выращивания личинок морских рыб и их кормов является формирование оптимальных микробиологических условий в системе искусственного выращивания рыб и их кормовых организмов путем снижения численности бактерий как в искусственных средах инкубации икры и выращивания личинок морских рыб на ранних стадиях развития, так и в средах культивирования их живых кормовых организмов (микроводорослей, коловраток, артемий).

Поставленная задача решается тем, что для обеззараживания среды перед помещением икры, в инкубатор предварительно инокулируют культуру микроводоросли Chlorella vulgaris (концентрация клеток в среде инкубирования ≈2⋅10⁵ кл⋅мл^-1), а в выростные емкости с личинками на стадии эндогенного питания добавляют культуру Ch. vulgaris из расчета ≈4⋅10⁴ кл⋅мл^-1, затем на стадии экзогенного питания личинок рыб коловратками в среду добавляют фильтрат хлореллы из расчета 50 мл⋅л^-1, концентрация исходной культуры микроводорослей ≈10⁷ кл⋅мл^-1; перед закладкой цист артемий на выклев культуру Ch. vulgaris добавляют в среду культивирования артемий из расчета ≈0,4⋅10⁶ кл⋅мл^-1. В способе используют культуру Ch. vulgaris, находящуюся в конце фазы экспоненциального роста. В инкубаторах икру после добавления культуры Ch. vulgaris выдерживают 1 час без протока, повторяя процедуру ежедневно после чистки дна инкубаторов вплоть до выклева.

Основными векторами передачи патогенных бактерий личинкам рыб при искусственном выращивании являются поверхность икры, среда выращивания и кормовые организмы (коловратки, артемий). В отсутствии правильной дезинфекции икры, через нее могут передаваться бактериальные инфекции от производителей к личинкам.

Колонизация поверхности икры бактериями (формирование эпифлоры икры) происходит в течение нескольких часов после оплодотворения. Бактерии, входящие в состав эпифлоры, вырабатывают протеолитические ферменты, которые могут негативно влиять на развитие эмбриона; обрастание икры препятствует его дыханию, замедляя развитие и выклев. Одним из альтернативных методов снижения уровня бактериальной контаминации (и особенно снижения титра быстро растущих потенциальных патогенов - бактерий-оппортунистов) среды выращивания является использование антибактериальных свойств одноклеточных микроводорослей. Известна антибактериальная активность микроводорослей рода Chlorella, которая была обнаружена в 1940-х годах (Pratt et al., 1944), однако до настоящего времени функциональные механизмы этой активности неясны. Для ассоциированной микрофлоры неаксеничных культур микроводорослей рода Chlorella характерно присутствие преимущественно грампозитивных бактериальных изолятов, около 30% которых ингибируют in vitro рост известных патогенов (Makridis et al., 2006). Но и аксеничные культуры видов рода Chlorella, в отсутствие культивируемых ассоциируемых бактерий, оказывают достоверное ингибирование in vitro известных патогенов рыб рода Vibrio (Kokou et al., 2012). Бактерицидная активность хлореллы, по-видимому, связана также с ее экзометаболитами, в составе которых обнаружено до 25-40% полисахаридов (Lewin, 1962), значительное количество гликолевой кислоты (Watt, Fogg, 1966; Максимова, Даль, 1975), а также муравьиной и уксусной кислот (Максимова, Пименова, 1969).

Переход личинок на экзогенное питание живыми кормами - наиболее проблемный в отношении возможных вспышек бактериальных инфекций этап культивирования рыб. Начало питания (открытие пищеварительного канала) инициирует колонизацию кишечника личинок микрофлорой, ассоциированной со средой выращивания и живыми кормами, в составе которой могут быть и условно патогенные бактерии (в том числе и переданные через икру от производителей). В интенсивных условиях выращивания, при высоких плотностях культивируемых организмов (например, коловраток), складывается благоприятная для быстрого роста оппортунистических бактерий среда и их патогенность повышается, что приводит к вспышкам инфекционных заболеваний и смертности личинок. В поверхностных слоях внешней оболочки артемий - живого кормового организма, которым кормят выращиваемых личинок калкана, также локализуется значительное число бактерий, которые не всегда элиминируются дезинфицирующими средствами.

Технический результат, проявляющийся при осуществлении способа, заключается в том, что:

- применение Ch. vulgaris позволяет создать оптимальные условия культивирования личинок за счет внесения в среды выращивания вместе с культурой хлореллы ее метаболитов, обладающих антибактериальным действием, а также заселения сред выращивания ассоциированными с хлореллой бактериями, благоприятными для жизнедеятельности личинок (эубиотиками), сдерживающими рост оппортунистической микрофлоры;

- формирование здорового сбалансированного микробиологического сообщества путем внесения неаксеничной культуры Ch. vulgaris с ассоциированной микрофлорой при открытии личинками рта и пассивном заглатывании воды обеспечивает первичную колонизацию кишечника личинок здоровой микрофлорой и сдерживает рост численности бактерий-оппортунистов в среде выращивания при переходе личинок на экзогенное питание;

- использование Ch. vulgaris при инкубации артемий позволяет увеличить синхронность выклева артемий из цист, снизить уровень бактерий в среде инкубации цист и интенсивность бактериальной колонизации поверхности науплиев и метанауплиев Artemia salina - потенциального вектора передачи патогенных бактерий личинкам рыб;

- вид Ch. vulgaris является технологичным, а получение необходимой биомассы этого вида микроводорослей возможно в короткие сроки;

- условия инкубации икры, культивирования личинок и их кормовых организмов приближаются к естественным, что позволяет избежать рисков, связанных с применением антибиотиков или других дезинфицирующих средств, и повысить качество аквакультурной продукции;

- снижается интенсивность бактериальной колонизации поверхности икры и среды ее инкубации, и, тем самым, снижается вероятность вспышки инфекционных заболеваний личинок рыб.

Заявляемый способ соответствует критериям новизны и технического уровня, т.к. впервые предложена альтернативная химическим способам дезинфекции методика снижения численности оппортунистических бактерий на проблемных в отношении возможной вспышки патогенных инфекций этапах культивирования морских рыб и их кормовых организмов; впервые предложен способ использования фильтрата микроводоросли Ch. vulgaris в качестве антибактериального агента в среде выращивания при питании личинок живыми кормовыми организмами. Применение свежего фильтрата позволяет снизить уровень бактерий в среде, сохраняя необходимый, соответствующий технологии выращивания, баланс численности организмов (личинки/кормовые объекты), избежать нежелательного изменения биохимического состава коловраток, который может произойти в результате их питания хлореллой.

Изобретение реализуется следующим образом:

1. Инкубацию икры проводят при стандартных условиях. Перед помещением в инкубаторы икру промывают озонированной водой с целью обеззараживания, затем помещают в инкубаторы, в которые предварительно инокулируют культуру микроводоросли Chlorella vulgaris, до достижения их концентрации в среде инкубации ≈2⋅10⁵ кл⋅мл^-1, и выдерживают около 1 часа без протока. Процедуру повторяют ежедневно, после чистки дна инкубаторов вплоть до выклева. Присутствие хлореллы позволяет снизить более чем вдвое интенсивность бактериальной колонизации поверхности икры и сбалансировать бактериальное сообщество в среде инкубации, так как в присутствии хлореллы в бактериальном сообществе доминируют медленно растущие, преимущественно К-стратеги.

2. После переноса выклюнувшихся личинок в выростные бассейны, накануне перехода личинок от стадии эндогенного питания к экзогенному питанию, для предупреждения вспышки численности оппортунистических бактерий и для создания сбалансированного микробиального сообщества в воде, которую пассивно заглатывают личинки и которая может формировать первичную микрофлору кишечника личинок, в выростные емкости добавляют культуру Ch. vulgaris в из расчета ≈4⋅10⁴ кл⋅мл^-1.

3. На стадии экзогенного питания для предупреждения роста численности бактерий в среде с личинками, активно питающимися коловратками, в выростные емкости добавляют только фильтрат культуры хлореллы (без клеток) (50 мл⋅л^-1, концентрация исходной культуры ≈10⁷ кл⋅мл^-1), т.к. коловратки могут дать дополнительную нежелательную вспышку численности и изменить в неблагоприятную для личинок рыб сторону свой биохимический состав в результате питания клетками хлореллы.

4. При инкубации цист артемий с целью получения науплиев, второго кормового организма личинок рыб, культуру Ch. vulgaris добавляют в среду перед закладкой цист на выклев из расчета ≈0,4⋅10⁶ кл⋅мл^-1. Присутствие Ch. vulgaris в среде инкубации артемий снижает колонизацию покровов науплиев бактериями, сокращает время выклева науплиев из цист и обеспечивает более синхронный метаморфоз артемий при переходе от науплиальной к метанауплиальной стадии.

Во всех случаях (1-4) используют культуру Ch. vulgaris, находящуюся в конце фазы экспоненциального роста (при концентрации 4-10⁷ кл⋅мл^-1), которую предварительно адаптируют в течение нескольких часов к условиям дальнейшего использования (температура, освещенность).

Предложенные цифровые значения есть результат многочисленных экспериментов, проведенных авторами, позволяющих выполнить поставленную задачу максимально эффективно.

Дополнительно к операциям известной технологии культивирования камбалы/калкан проводят:

1) Культивирование микроводоросли Ch. vulgaris в соответствии со стандартными методиками;

2) Подготовку фильтрата культуры Ch. Vulgaris;

3) Инкубацию икры с добавлением Ch. Vulgaris;

4) Культивирование коловраток Brachionus plicatilis в соответствии со стандартными методиками;

5) Добавление фильтрата Ch. vulgaris одновременно с коловратками в среду культивирования личинок;

6) Инкубацию цист артемий с целью получения науплиев с добавлением Ch. vulgaris.

Пример реализации способа

Предлагаемый способ снижения численности бактерий-оппортунистов в средах выращивания личинок морских рыб и их кормов был успешно апробирован при инкубации икры и выращивании личинок черноморского калкана и его основных кормовых организмов (коловраток, артемий) в пилотных установках. Методом проточной цитометрии с предварительной окраской бактерий флуоресцентным ДНК маркером было подтверждено, что в средах инкубации икры, выращивания личинок на стадиях эндо- и экзогенного питания, инкубации артемий A. salina с добавлением клеток и фильтрата Ch. vulgaris численность бактерий была достоверно ниже, чем в контроле. Интенсивность бактериальной колонизации поверхности икры и науплиев артемий также была достоверно ниже таковой в контроле.

Культивирование микроводоросли Ch. vulgaris в соответствии со стандартными методиками.

Микроводоросли Ch. vulgaris были получены из коллекции живых культур морских микроводорослей отдела экологической физиологии водорослей ФГБУН ИМБИ (г. Севастополь). Культуры выращивали в накопительном режиме на среде Уолна при температуре 24±1°C. Освещение осуществляли круглосуточно с помощью люминесцентных ламп LD-40 при интенсивности 5000 люкс. Культуру Ch. vulgaris адаптировали к условиям дальнейшего использования в течение суток. Численность клеток в исходной культуре хлореллы, использованной на разных этапах культивирования, составляла 2⋅10⁷-10⁷ кл⋅мл^-1.

Подготовка фильтрата культуры Ch. vulgaris

Фильтрат готовили из культуры микроводоросли Ch. Vulgaris, находящейся в экспоненциальной фазе роста, с помощью 47-мм нитроцеллюлозных мембран (диаметр пор 0,2 мкм) и фильтровального оборудования Sartorius (Германия). Численность клеток в исходной культуре хлореллы, из которой готовили фильтрат, составляла ≈10⁷ кл⋅мл^-1. Клетки Ch. vulgaris, отделенные от фильтрата, в дальнейшем использовали при выращивании культур коловраток.

Процедура инкубации икры с добавлением Ch. vulgaris.

Оплодотворенную икру на стадии бластулы промывали подготовленной морской водой и помещали в инкубаторы, куда предварительно добавляли культуру Ch. vulgaris. Плотность икры в инкубаторах составляла ≈1000 экз.⋅л^-1, клеток Ch. vulgaris 0,2⋅10⁶ кл⋅мл^-1.

Культивирование коловраток В. plicatilis в соответствии со стандартными методиками

Партеногенетический клон коловраток В. plicatilis культивировали в накопительном режиме при постоянном освещении и температуре 24±1°C, используя подготовленную морскую воду (фильтрация через картриджные фильтры 10, 5, 1 мкм, обработка ультрафиолетом, пастеризация).

Процедура добавления коловраток и фильтрата Ch. vulgaris в среду культивирования личинок.

Для оптимизации биохимического состава коловраток как кормового организма для личинок рыб их предварительно концентрировали и насыщали соответствующими видами микроводорослей, затем промывали проточной морской водой и помещали в емкости с начинающими экзогенно питаться личинками, в выростную среду которых предварительно был добавлен фильтрат хлореллы. Плотность посадки личинок составляла 40 экз.⋅л^-1. Средняя плотность коловраток в выростных емкостях личинок составляла примерно - 5 экз.⋅мл^-1. Фильтрат хлореллы добавляли в среду с личинками из расчета 50 мл, концентрация исходной культуры ≈10⁷ кл⋅мл^-1.

Процедура получения науплиев из цист артемий с добавлением Ch. vulgaris.

Предварительно декапсулированные цисты артемий помещали в конические сосуды, содержащие стерильную морскую воду, и содержали при температуре 28°C, постоянном освещении 5 тыс. люкс и интенсивном барботаже. Исходная концентрация цист артемий составляла 1 г⋅л^-1, концентрация добавленных в инкубационную среду клеток хлореллы 0,4⋅10⁶ кл⋅мл^-1. Выклюнувшихся науплиев отделяли от оболочек, после чего концентрировали и промывали стерильной морской водой.

Таким образом, применение микроводоросли Ch. vulgaris по разработанной схеме позволяет сформировать оптимальные микробиологические условия в системе искусственного выращивания рыб и их кормовых организмов. Данный способ обеспечивает снижение численности бактерий-оппортунистов, обеспечивая сбалансированное бактериальное сообщество в средах выращивания организмов, снижение интенсивности бактериальной колонизации их поверхности без применения антибиотиков и, как следствие, повышение качества и выживаемости личинок на ранних стадиях развития.