Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогнозирования задержки роста плода у беременных с плацентарной недостаточностью

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и перинатологии, и найдет широкое применение при разработке акушерской тактики ведения пациенток с задержкой роста плода (ЗРП).

Особый интерес со стороны акушеров-гинекологов проявляется к задержке роста плода, связанного с высокой перинатальной заболеваемостью (17-36%) и смертностью (8-24%) новорожденных (ВОЗ). Достоверными морфологическими критериями плацентарной недостаточности являются признаки задержки (недостаточности) первой (в 6-8 нед.) и главное второй (в 14-16 нед.) волны инвазии цитотрофобласта в стенки маточно-плацентарных артерий (Милованов А.П., 1999), но клинические признаки заболевания ни в I, ни во II триместрах не проявляются, если нет эктрагенитальной или нейроэндокринной патологии. Приведенные факты делают прогнозирование тяжелых форм задержки роста плода совершенно необходимым, причем приоритет должен отдаваться определению развития данного осложнения в I триместре беременности. Обычно правильно подобранное лечение позволяет избежать развития тяжелых форм ЗРП.

В связи с этим актуальным представляется выяснение ранних диагностических маркеров задержки роста плода (ЗРП) с целью проведения своевременных лечебных мероприятий.

Анализ патентной и научно-медицинской литературы позволил проанализировать наличие существующих способов диагностики задержки роста плода. Более современным приемом диагностики ЗРП служит использование нескольких фетометрических показателей, но они являются информативными только в третьем триместре беременности - в 26-38 недель (А.Н. Стрижаков, А.Н. Бунин, М.В. Медведев // Акушерство и гинекология. 1988. №6. С. 32-35). Ультразвуковая диагностика ЗРП основана на сопоставлении фетометрических показателей, полученных в результате исследования, с нормативными показателями для данного срока беременности. Одним из наиболее информативных ее параметров является бипариетальный размер головки плода. Однако измерение только этого показателя не может быть использовано для выявления задержки роста плода.

В последнее время для выявления синдрома ЗРП применяют допплерометрическое определение объемного кровотока в аорте плода, пупочной вене или внутренней сонной артерии с последующим анализом кривых скоростей кровотока. Учитывая, что качественная оценка кровотока с помощью систолодиастолического отношения (С/Д) и индекса резистентности отражает одни и те же закономерности, в широкой клинической практике для диагностики ЗРП используют также определение пульсационного индекса (ПИ), увеличение которого имеет место при ЗРП в пупочной вене и резкое снижение во внутренней сонной артерии. Однако все эти исследования наиболее достоверны в сроке с 17-20 недель развития беременности. При плацентарной недостаточности и задержке роста плода происходят изменения в допплерограммах, но они носят неспецифический характер и в большем проценте случаев возникают во II триместре гестации. Диагностическая ценность одноразовой динамической сцинтиграфии при задержке роста плода составляет 75-79% (Е.М. Вихляева, З.С. Ходжаева // Акушерство и гинекология. 1984. №6. С. 18-24).

Известен способ диагностики угрожающего состояния плода по патенту №2076624 (1997 г. ), который дает возможность осуществлять одновременную регистрацию электрической активности сердца матери и плода, и при отсутствии коррелятивной взаимосвязи диагностируют угрожающее состояние плода или степень нарушения состояния плода. Относительно данного аналога можно подчеркнуть то, что применение его в клинической практике позволяет провести оценку наличия отклонений в развитии плода в значительно более позднем сроке беременности.

Известен способ диагностики задержки внутриутробного развития плода, описанный в патенте №2086981 (1997 г. ), по которому в венозной крови женщины определяется абсолютное содержание В-лимфоцитов (Ва) и относительное содержание нейтрофилов, имеющих рецепторы к С3 компоненту комплемента (ЕАС-РОН), и при показателях Ва, больших или равных 0,3×109 мкг/л, и ЕАС-РОН, больших или равных 16%, состояние плода оценивается как несоответствующее физиологическому развитию и диагностируется задержка внутриутробного развития плода.

Данный способ не специфичен, так как изменения в содержании В-лимфоцитов, а также нейтрофилов могут выявляться при самых различных заболеваниях матери, не связанных с ЗРП, а также точность способа составляет лишь 80%.

В патенте №2172958 (2001 г. ) предложен способ диагностики ЗРП, который позволяет осуществить диагностику на ранних этапах развития задержки роста плода путем анализа периферической крови, включающий выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции и определения аллеля PL-АII гена гликопротеина IIIA.

Следует отметить, что данный способ имеет главный недостаток, прежде всего ограниченность применения, ввиду сложности его выполнения, выражающейся в многоэтапности и длительности его исполнения.

Еще одним способом раннего прогнозирования синдрома задержки развития плода является определение в периферической венозной крови содержания HLA-DR + моноцитов (патент 2265224, 2004 г.), и при его значении, равном или меньшем 57,9%, прогнозируют развитие синдрома ЗРП.

Следует отметить, что данный способ также ограничен в применении ввиду сложности и длительности его выполнения.

В патенте РФ №2331365 (2007) предложен способ диагностики синдрома задержки внутриутробного развития плода по определению в крови беременной женщины содержания аллантоина, и при значениях его концентрации от 2,9 до 5,8 мкмоль/л диагностируют синдром задержки внутриутробного развития плода.

Данный способ не является специфичным, так как выраженное уменьшение данного показателя наблюдается не только при ЗРП, а также при неразвивающейся беременности и ранних самопроизвольных абортах.

Известен способ диагностики задержки роста плода (патент РФ №2 425 379, 2011) путем исследования биологической жидкости беременной женщины, отличающийся тем, что у беременной в сроки 16-19 недель в амниотической жидкости методом капиллярного электрофореза определяют содержание аргинина и пролина, рассчитывают коэффициент их отношения и при величине коэффициента, равного 3,2 и выше, диагностируют задержку роста плода.

К недостаткам данного метода следует отнести возникновение угрозы прерывания беременности в силу травматичности метода при проведении амниоцентеза, а также диагностическую, а не прогностическую направленность метода.

Известен способ прогнозирования задержки внутриутробного роста плода (патент №2526178, 2014), отличающийся тем, что с ранних сроков беременности определяют относительное содержание CD3+CD16+56+-лимфоцитов, уровень С3-компонента комплемента и растворимого рецептора фактора некроза опухоли (sTNF-R) в венозной крови женщины, вычисляют прогностический индекс (PI) по формуле:

Р1=-0,8911X1-0,0321X2-2,3669X3+11,0779,

где X1 - относительное содержание CD3+CD16+CD56+ - лимфоцитов, %;

Х2 - концентрация С3-компонента комплемента, мг/дл;

Х3 - концентрация sTNF-R, нг/мл

и при PI менее 0 прогнозируют задержку внутриутробного роста плода во второй половине беременности, а при PI более 0 делают заключение о низком риске развития данного патологического состояния.

К недостаткам данного способа следует отнести его трудоемкость в связи с необходимостью определения большого количества показателей и длительном времени выполнения.

Прототипом заявляемого изобретения выбран способ прогнозирования задержки внутриутробного развития плода (патент №2246733, 2005) путем исследования сыворотки крови беременной, отличающийся тем, что определяют содержание инсулиноподобного фактора роста (ИФР) и сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР), рассчитывают коэффициент их отношения и при величине коэффициента 28,5 и ниже диагностируют задержку развития плода.

Данный способ обладает рядом несовершенств:

1. Способ недостаточно специфичен - изменение уровня факторов роста наблюдается при различных осложнениях беременности - гестозе, неразвивающейся беременности, угрозе прерывания беременности, преждевременных родах (А.В. Орлов и соавт.// Росс, вестник акуш. и гин. - 2005. - №3. С.7-9).

2. Метод трудоемок и длителен по времени его выполнения.

3. Осуществление метода требует дорогостоящей аппаратуры и импортных наборов реагентов для иммуноферментного анализа, что затрудняет его широкое применение в клинической практике.

Указанные недостатки устраняются в заявляемом изобретении.

Задача изобретения: повышение точности и специфичности путем разработки специфического способа диагностики задержки роста плода (ЗРП).

Поставленная задача решается тем, что тем, что в венозной крови женщин в I триместре беременности определяют уровень плацентарного белка РР 13 и при снижении его уровня до 5,34 пг/мл и менее прогнозируют развитие плацентарной недостаточности с задержкой роста плода на последующих этапах беременности.

Технический результат, получаемый в ходе использования изобретения, состоит в повышении точности диагностики задержки роста плода, что позволяет назначать своевременную адекватную терапию в более раннем периоде.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается диагностировать ЗРП у беременных в раннем периоде, исследуя в уровень плацентарного белка РР13 в венозной крови.

Нарушение продукции ангиогенных факторов (сосудисто-эндотелиального фактора роста, фактора роста плаценты) представляет собой универсальный патогенетический процесс в формировании основных патологических состояний беременности (Орлов В.И., Орлов А.В., 2006; Боташева Т.Л., 2014). Помимо ангиогенных факторов, значительный интерес представляют плацентарные белки, которые могут принимать активное участие в процессе имплантации. Особый интерес в генезе развития плацентарной недостаточности отводят недостаточной выработке синцититрофобластом плацентарного белка РР-13. В период имплантации бластоцисты в эндометрий происходит инвазия ворсин трофобласта и преобразование материнской спиральной артериолы. Было обнаружено, что РР13 продуцируется синцитиотрофобластом, выделяется в межклеточное пространство и участвует в формировании определенной буферной зоны, которая облегчает вторжение трофобласта (Kliman H.J., Sammar М., Grimpel Y.I. 2012 г.), РР 13 имеет несколько функций: 1) обладает лизофосфолипазной активностью, участвует в освобождении жирных кислот, в частности линолейковой к-ты, которая содействует нормальной имплантации; 2) связывается в сахарные остатки внеклеточных матричных молекул (как, например, annexinll), который создает «молекулярный мост» для плацентарной имплантации в эндометрий; 3) участвует в выработке простагландинов, в частности, простациклина, который играет важную роль в сосудистом переоборудовании маточных спиральных артерий; 4) связывается в бета- и гамма-актин в пределах трофобласта, таким образом, облегчая проникновение и формирование плацентарного пласта 5) связан с иммунологическими аспектами и гемостазом, т.к. в зоне, где большая концентрация РР 13, было обнаружено много Т-клеток, нейтрофилов и макрофагов (Schneuer F.J., Nassar N., Tasevski V., Ashton A.W. 2012 г.).

В своей основе плацентарная недостаточность является результатом сложной многогранной и в отдельных случаях дезадаптивной реакции плода и плаценты на различные патологические состояния материнского организма, исследование механизмов формирования которых представляет значительный интерес и по сей день.

Наши исследования показали, что абсолютный уровень РР 13 при ЗРП, в отличие от физиологического течения беременности, был статистически значимо ниже в I триместре гестации (р=0,0125), т.к. РР 13 вырабатывается синцитиотрофобластом. Также в нашем исследовании было установлено, что при недостатке РР13 происходит неполноценная инвазия ворсин TP, которая приводит к развитию ПН и формированию тяжелых форм ЗРП. Изучая экспрессию плацентарного белка РР 13, было обнаружено, что при его уровне РР 13 менее 5,34 диагностировали в 97% случаев ЗРП. Исследования уровня плацентарного белка РР13 необходимо использовать для прогноза ЗРП и выбора адекватной акушерской тактики, это обусловлено тем, что нами установлена взаимосвязь между исходами родов и уровнем ЗРП: у женщин с ЗРП при сниженном уровне РР13 роды в срок отмечались в 46% случаев, преждевременные роды в 54% случаев (р=0,0215). Таким образом, при ЗРП снижение уровня РР 13 ниже 5,34 в первом триместре гестации является прогностически значимым признаком по развитию ЗРП у женщин с плацентарной недостаточностью (чувствительность 92%, специфичность 93%).

Подробное описание способа и примеры его клинического использования.

Забор материала для исследования проводился в одно и то же время суток, натощак с использованием современных методов анализа. Ультразвуковое и допплерометрическое исследование в динамике проводились на одном и том же аппарате, одним и тем же специалистом.

Указанный способ осуществляется путем исследования венозной крови женщин с плацентарной недостаточностью в 1 триместре беременности и определении уровня плацентарного белка РР 13. Забор материала для исследования проводился в одно и то же время суток, натощак с использованием современных методов анализа. Ультразвуковое и допплерометрическое исследование в динамике, проводились на одном и том же аппарате, одним и тем же специалистом.

Уровень РР13 в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа наборами фирмы R&D System (USA).

Промывочный буфер, растворы стандартов, субстратный раствор готовили согласно инструкции к набору.

Во все лунки планшета, покрытые мышиными поликлональными антителами к РР 13 человека, вносили по 100 мкл рабочего буфера. В лунку-бланк вносили 50 мкл раствора для разведения стандартов, в лунки для построения стандартной кривой вносили по 50 мкл приготовленных стандартных проб, в остальные лунки - по 50 мкл исследуемых проб. Накрывали планшет пленкой и инкубировали 2 часа при комнатной температуре при непрерывном встряхивании на шейкере ST 3 (Латвия).

По окончании инкубации промывали лунки планшета промывочным буфером 4 раза на промывочном устройстве для микропланшетов ELISA WASHNER HUMAN (USA).

Затем во все лунки вносили по 200 мкл раствора конъюгатаполиклональных антител к РР 13 человека с пероксидазой хрена. Инкубировали планшет при комнатной температуре в течение 2 часов при непрерывном встряхивании на шейкере ST 3 (Латвия).

Промывали планшет 4 раза промывочным буфером как описано выше.

Во все лунки вносили по 200 мкл свежеприготовленного раствора субстрата и инкубировали в течение 30 минут, защищая от прямых солнечных лучей.

Останавливали цветную реакцию добавлением 50 мкл стоп-реагента в каждую лунку.

Измерение оптической плотности при 450 нм и обсчет результатов проводили на фотометре MULTILABEL COUNTER 1420 (Финляндия).

В компьютерное обеспечение прибора вводили численные значения концентраций РР 13 в стандартных растворах и получали после измерения концентрацию РР 13 в опытных пробах в пг/мл.

При снижении уровня плацентарного белка РР 13 до 5,34 пг/мл и менее прогнозируют развитие плацентарной недостаточности с задержкой роста плода на последующих этапах беременности.

Работоспособность данного способа подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1.

Первобеременная, И-ва, 25 лет. Дата обследования 11.02.2014 г.

Проведено ультразвуковое исследование. Диагноз: Беременность 10 нед.

Произведено взятие венозной крови. Уровень РР 13 в сыворотке крови составил 6,83 пг/мл, что свидетельствует о благоприятном прогнозе течения беременности.

В сроке 28 недель проведено повторное ультразвуковое и допплерометрическое исследование. Данные УЗИ: БПР -71 мм на 28 нед. 5 дней; ОГ - 260 мм на 28 нед. 3 дня; ОЖ - 243 мм на 28 нед. 4 дня; ДБ - 54 мм на 28 нед. 5 дней. Плацента I ст. зрелости, толщина 28 мм. Диагноз: Беременность 28 нед. Нарушений маточно- и фетоплацентарной гемодинамики не выявлено.

Пример 2.

Первобеременная, Н-ва, 28 лет. Дата обследования 15.02.2014 г.

Проведено ультразвуковое исследование. Диагноз: Беременность 9 нед.

Произведено взятие венозной крови. Уровень РР 13 в сыворотке крови составил 5,34 пг/мл, что свидетельствует о высокой вероятности развития плацентарной недостаточности и задержки роста плода во 2-3 триместре.

В сроке 32 недель проведено повторное УЗ и допплерометрическое исследование. Данные УЗИ: БПР - 72 мм на 29 нед.; ОГ - 267 мм на 29 нед.; ОЖ - 250 мм на 29 нед. 2 дня; ДБ - 55 мм на 29 нед. 3 дня. Плацента II-III ст. зрелости, толщина 36 мм. Диагноз: Беременность 32 нед. Симметричная форма задержки роста плода. УЗ признаки плацентарной недостаточности. Нарушение маточно- и фетоплацентарной гемодинамики 2 степени.

По заявляемому способу обследовано 115 женщин, в венозной крови которых в I триместре беременности определяли уровень плацентарного белка РР13 в 6-9 нед. беременности. У 65 пациенток с уровнем РР13 ниже 5,34 во II и III триместрах отмечалось развитие плацентарной недостаточности, отягощенной задержкой роста плода ЗРП. 50 женщин, у которых уровень РР13 был выше 5,34, беременность протекала без задержки роста плода. При проведении статистического анализа эмпирических данных использовались возможности табличного процессора Excell 2003 и пакетов прикладных программ («Мегастат» и Statistica 6.0).

Таким образом, предложен способ прогнозирования задержки роста плода при плацентарной недостаточности в I триместре беременности на основании определения такого информативного показателя как уровень плацентарного белка РР 13, позволяющий эффективно оценить возможность возникновения акушерских осложнений, обеспечить своевременность оказания акушерской помощи и, тем самым, снизить перинатальные потери.

Вышеизложенное подтверждает диагностическую ценность заявляемого метода. Таким образом, заявляемый способ является более эффективным по сравнению с известными и обладает рядом преимуществ:

1. Способ специфичен (определение ЗРП по уровню РР13 является специфическим методом).

2. Обладает высокой точностью. Достоверность составляет 100%.

3. Способ высокочувствителен, дает возможность определения ЗРП на доклинической стадии.

Апробация заявляемого изобретения проведена на достаточном по объему клиническом материале, что подтвердило работоспособность метода и возможность его применения в клинической практике.