Результат интеллектуальной деятельности: Способ определения массы микрочастицы в переменном электрическом поле

Изобретение относится к способам определения массы микрочастицы (биологических клеток, эритроцитов и других отдельных мелкодисперсных частиц шарообразной формы микронного размера), находящейся в суспензии, и может быть использовано в медицине, биофизике, вирусологии, космонавтике, производстве продуктов питания.

Предшествующий уровень техники

Известны способы определения массы отдельного объекта путем расчета по формулам с использованием известных величин: силы, скорости и ускорения, действующей на объект.

Известен способ определения массы объекта, реализованный в устройстве, в котором объект с искомой массой приводится в прямолинейное поступательное движение. Экспериментальным путем находится скорость и далее производится расчет силы и искомой массы [авторское свидетельство СССР №964472, опубл. 10.10.1982; авторское свидетельство СССР №981831, опубл. 18.12.1982; авторское свидетельство СССР №518639, опубл. 22.07.1976].

Известны также способы определения массы объекта, в которых поступательное движение объекта заменяется вращательным с целью создания центробежной силы. Расчет массы производится на основании выше указанных известных величин. В состав системы для реализации способа входят следующие основные устройства: центрифуга, двигатель, держатель, балансирующий противовес, прибор для измерения действующей силы. Искомая масса устанавливается на держатель. Под действием центробежной силы масса смещается. Прибором измерения силы определяется действующая ее величина и далее рассчитывается скорость и ускорение [патент ФРГ №4211760, опубл. 19.08.1993; патент ФРГ №4216279, опубл. 06.05.1993]. Основным недостатком выше приведенных способов является: зависимость точности измерения искомой массы объекта от частоты, наличие детонации вращения ротора центрифуги, необходимость юстировки местоположения балансирующего противовеса, калибровка измерительного прибора.

Другой способ реализован в устройстве для измерения массы исследуемого объекта в условиях невесомости и отсутствия естественной силы гравитации. Устройство предусматривает трубчатый канал, в котором под действием магнитного поля объект приводится в поступательное движение с ускорением, а также средство для измерения времени прохождения объектом фиксированного расстояния и, в конечном итоге, расчета искомой массы по результатам измерения. В противоположных концах трубчатого канала размещаются ферромагнитный элемент и магнит, связанные со средством для размещения объекта гибкой нерастяжимой нитью для передачи этому средству ускоряющего усилия от ферромагнитного элемента [патент РФ №2410651, опубл. 27.01.2011]. Способ и устройство характеризуются высокой стоимостью, зависимостью точности измерения искомой массы от свойств ферромагнитного материала и стабильности напряженности магнитного поля, необходимостью юстировки, калибровки измерительного устройства.

В другом аналоге искомую массу присоединяют к свободному концу консольной рессоры. Величина массы находится путем измерения частоты колебаний рессоры и сравнения ее с ранее известными. Равенство частот колебаний рессоры соответствует равенству искомой и заранее известной массы [патент США №6756548, опубл. 29.06.2004].

Известен способ определения массы механической частицы (авторское свидетельство №1788443, опубл. 15.01.1993 г.). Способ заключается в высокоскоростном разгоне механической частицы и взаимодействии с преградой. В качестве преграды используют жидкостный калориметр. При этом измеряют температуру жидкости калориметра до и после взаимодействия механической частицы с жидкостью, измеряют скорость механической частицы в момент взаимодействия с жидкостью, а массу механической частицы вычисляют по формуле.

Недостатком всех перечисленных способов является невозможность их использования для определения массы мелкодисперсных частиц микронного размера.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ определения массы аэрозольной микрочастицы (патент Германии №102011056045, МПК G01N 15/00, опубл. 06.06.2013 г.). Способ определения массы аэрозольной частицы включает формирование измерительного объема между двумя электродами, соединенными с источником переменного напряжения с частотой ~50 Гц для формирования переменного электрического поля и расположенными в камере с жидкостью, диспергирование в измерительный объем частицы, измерение параметров взаимодействия частицы с электрическим полем и последующее вычисление ее массы. В качестве двух электродов используют обкладки конденсатора, а массу частицы определяют с использованием блока измерения, который определяет результат изменения диэлектрической проницаемости между обкладками конденсатора, полученной путем изменения емкости между обкладками конденсатора.

Однако в прототипе для определения массы единичной частицы микронного размера требуется сложное и дорогостоящее оборудование для измерения линейных размеров измерительного конденсатора с абсолютной погрешностью менее 0.1-0.01 мкм, создания термостатированных условий измерений [Иоссель Ю.Я., Кочанов Э.С., Струнский М.Г. Расчет электрической емкости. - 2-е изд., перераб. и доп. - Л.: Энергоиздат. Ленинград, отд-ние, 1981. - 288 с.]. Кроме того, существующие технологии манипуляции единичными частицами (клетками) микронного размера являются дорогостоящими и требуют значительных временных и материальных затрат, высокой квалификации со стороны исполнителей. Технологии нашли свое применение лишь для проведения уникальных операций или научных исследований в области клеточных технологий [Экстракорпоральное оплодотворение и его новые направления в лечении женского и мужского бесплодия / под ред. В.И. Кулакова, Б.В. Леонова. - М.: Медицинское информационное агентство, 2000. - 782 с.].

Техническим результатом заявляемого изобретения является обеспечение возможности измерения массы единичных биологических и других микрочастиц с использованием более простых технических средств.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения массы микрочастицы, включающем формирование измерительного объема между двумя электродами, соединенными с источником переменного напряжения для формирования переменного электрического поля и расположенными в камере с жидкостью, диспергирование в измерительный объем частицы, измерение параметров взаимодействия частицы с электрическим полем и последующее вычисление ее массы, согласно изобретению, между электродами формируют неоднородное переменное электрическое поле (НПЭП), а в качестве жидкости используют жидкую среду с низкой электропроводностью (ионной силой) с заданной температурой (K) и характеристиками, не меняющими биохимические свойства и физические параметры частицы, причем частицу приводят в возвратно-поступательное движение с заданной амплитудой Х_m, равной (0,5÷0,6) расстояния между электродами в измерительном объеме под действием неоднородного переменного электрического поля со средней напряженностью Е~10⁴÷10⁶ В/м, напряжением 4÷8 В и частотой в диапазоне 1÷18 Гц, осуществляют запись видеоизображения возвратно-поступательного перемещения частицы между электродами в измерительном объеме, обрабатывают видеоизображение компьютерной программой с получением данных о радиусе частицы r_мч, частоте и амплитуде ее колебания (X_m) между электродами, рассчитывают программными средствами скорость возвратно-поступательного движения частицы в соответствии с уравнением

,

а массу (m_мч) частицы вычисляют в соответствии с уравнением

, где:

K - постоянная Больцмана, физическая постоянная 1,38 10^-23 [Дж/K], определяющая связь между температурой и энергией;

Т - температура [K];

m_пр=(2/3)ρ_жπr_мч³ - присоединенная масса частицы [кг];

ρ_ж - плотность жидкости, в которой находится частица в форме шара [кг/м³];

r_мч - радиус частицы [м];

π=3,14.

В качестве жидкой среды используют растворы с низкой электропроводностью (ионной силой), например, дистиллированную воду или изотонический 0,3 М раствор сахарозы, с содержанием NaCl 2,5 мМ для эритроцитов животных [Диэлектрофорез в диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний / В.М. Генералов, [и др.]. - Новосибирск: Церис, 2011. - 172 с.]. Например, в качестве жидкой среды используют дистиллированную воду при определении массы микрочастицы, представляющей собой латексную частицу или отдельную спору бактерий, или 0,3 М раствор сахарозы при определении массы микрочастицы, представляющей собой отдельный эритроцит животных или отдельную вегетативную клетку бактерий.

Для расчета массы частицы используется подход, в соответствии с которым для тела, совершающего гармоническое колебание, составляется уравнение энергетического баланса [Пановко Я.Г. Введение в теорию механических колебаний. - М.: Наука, 1987. - 352 с.]. В левой части уравнения записывается кинетическая энергии W_к поступательного движения частицы, а в правой части W_п - ее потенциальная энергия, запасаемая индуцированным диполем частицы, который возникает в ответ на воздействие внешнего электрического поля.

После выключения поля кинетическая энергия преобразуется в тепловую. Вязкоупругие свойства среды (суспензии) стремятся привести частицу к равновесному состоянию (релаксация) на уровне энергии Броуновского движения (3/2)KT [Лойцянский Л.Г. Механика жидкости и газа. - М.: Наука, 1987. - 840 с.].

Согласно гармоническому закону изменения электрического поля, мгновенные значения: положения материальной точки x, принадлежащей частице, ее скорость и ускорение находятся из выражений (1) [Пановко Я.Г. Введение в теорию механических колебаний. - М.: Наука, 1987. - 352 с.]:

где X_m - амплитуда колебания материальной точки, принадлежащей частице.

Для механической модели колебания частицы с одной степенью свободы по каждой оси x, y, z существует собственный фактор энергии n_x, n_y, n_z, общая сумма которых равна единице [Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. Теоретическая физика. Т. 8. Электродинамика сплошных сред. - 2-изд., перераб. и доп.- М.: Наука, 1982. - 620 с.]. Для изотропной, сферической частицы вдоль оси x n_х=0,33. Учитывая также, что мгновенное значение амплитуды колебания x материальной точки по фазе совпадает с электрическим полем, а скорость и ускорение находятся в противофазе между собой, можно записать уравнения энергетического баланса кинетической W_K и потенциальной энергии W_n

где K - постоянная Больцмана, физическая постоянная 1,38 10^-23 [Дж/К], определяющая связь между температурой и энергией;

Т - температура [K];

W_эл - энергия электрического поля, затраченная на формирование индуцированного диполя в частице [Дж].

Уравнение (2) выполняется в момент равенства нулю гармонического напряжения на электродах измерительной ячейки. В этот момент индуцированный дипольный момент частицы и ее потенциальная энергия равны нулю, но кинетическая энергия максимальна.

Уравнение (3) выполняется в момент максимального значения напряжения на электродах измерительной ячейки. В этот момент потенциальная энергия частицы, а также величина ее индуцированного дипольного момента достигают своего максимального значения, но кинетическая энергия при этом равна нулю.

Таким образом, используя экспериментально измеренные величины - скорость и радиус r_мч для каждой отдельно наблюдаемой частиц, можно определить ее массу с учетом присоединенной m(_мч+пр):

Присоединенная масса шара равна массе, окружающей жидкости, которая помещается в половину его объема [Лойцянский Л.Г. Механика жидкости и газа. - М.: Наука, 1987. - 840 с.]:

где ρ_ж - плотность жидкости, в которой находится частица в форме шара [кг/м³];

r_мч - радиус частицы [м].

Уравнение для расчета искомой массы частицы, без учета присоединенной к ней, записывается в виде

Изобретение поясняется следующими графическими материалами. На фиг. 1. представлена конструкция измерительной ячейки. На фиг. 2 приведена система анализа для определения массы частицы.

Способ определения массы частицы реализуется с использованием измерительной ячейки 1 (фиг. 1), выполненной в виде оптически прозрачной пластины-матрицы 2 со съемным покровным стеклом 3. На пластине-матрице 2 нанесены два электрода 4, с зазором 5 относительно друг друга, соединенные с источником гармонического переменного напряжения со средней напряженностью Е>10⁵ В/м. Измерительная ячейка 1 установлена в системе анализа (фиг.2). Система анализа содержит генератор 6, подключенный через усилитель 7 к электродам 4 измерительной ячейки 1. Измерительная ячейка 1 соединена через микроскоп 8 и видеокамеру 9 с компьютером 10, имеющем монитор 11. Для измерения параметров неоднородного переменного электрического поля (НПЭП) к электродам 4 измерительной ячейки 1 подсоединены частотомер 12 и осциллограф 13.

Генератор (6) - ГСПФ-052 (ЗАО "Руднев-Шиляев" Россия, г. Москва). Усилитель (7) - Г3-112/1. Микроскоп (8) - Axiostar plus Carl Zeiss (Германия). Видеокамера (9) - DCR-PC9E «Sony» (Япония). Компьютер (10): Processor AMD Athlon™ 64 (32), 2,41 Gb. System Mainboard ISA AGP PCI USB firewire/1394. Monitor syncmaster173d 1280*1024.

Пример 1. Способ определения массы мелкодисперсных частиц (на примере латексных частиц) с помощью НПЭП осуществляют следующим образом. Способ включает подготовку: суспензии частиц, измерительной ячейки 1 (фиг. 1), системы анализа (фиг. 2), рабочем месте и посуды.

Подготовка суспензии. Латексные частицы вносят в одноразовые пластиковые пробирки с объемом 0,25 см³ и разводят дистиллированной водой. Путем разбавления добиваются такой концентрации, чтобы под микроскопом между электродами измерительной ячейки наблюдалось 1÷10 частиц.

Подготовка к выполнению измерений. Перед измерениями проводят подготовку рабочего места, посуды, автоматических пипеток, покровных стекол, дистиллированной воды, 0.3 М раствора сахарозы с 2,5 мМ NaCl, а также измерительной ячейки. Осуществляют подготовку к работе микроскопа 8, видеокамеры 9, генератора 6 и усилителя 7 согласно инструкциям по эксплуатации. Рабочее место включает лабораторный стол, на который устанавливают компьютер 10, монитор 11, усилитель 7, микроскоп 8 с видеокамерой 9, штатив с пробирками, пипетками, носиками к пипеткам, покровными стеклами с размером 18*18 мм и пинцет. На рабочем месте устанавливается три химических стакана: с дистиллированной водой (100 мл), спиртом (50 мл), для сбора отходов (250÷500 мл).

Подготовка посуды. В ходе подготовки к измерениям необходимо тщательно обеспечить чистоту используемой посуды, а также рабочего места.

Подготовка микроскопа 8. На микроскоп устанавливают объективы и окуляры, обеспечивающие режим "план" и увеличение в диапазоне 300÷630 раз. Общую подготовку микроскопа осуществляют согласно инструкции по эксплуатации. Настройка освещения, фокусировка на объект (частицы) осуществляется также согласно инструкции по эксплуатации. На экране монитора 11 компьютера 10 должно наблюдаться сфокусированное изображение граней электродов, частиц с выраженной яркостью, контрастностью и равномерно освещенных.

Подготовка усилителя 7. Усилитель 7 (Г3-112/1) устанавливают на стол рядом с компьютером 10. Производят его подключение к компьютеру 10 и измерительной ячейке 1 согласно функциональной схемы (фиг. 2.). Подготовка усилителя 7 к работе осуществляется в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Постоянная составляющая выходного напряжения усилителя не должна превышать ±50 мВ. Не допускается включение или выключение усилителя тумблером "сеть", если он подключен к измерительной ячейке и в ней находится суспензия частиц или какая-либо жидкость (дистиллированная вода, раствор сахарозы). Переходные электрические процессы, возникающие на выходе усилителя, в моменты включения/выключения могут разрушить электроды измерительной ячейки.

Подготовка видеокамеры 9. Видеокамеру 9 устанавливают в оптический ход микроскопа 8 (тринокулярный путь) и жестко фиксируют. Подготовка к работе осуществляется согласно инструкции по эксплуатации. В процессе измерений рекомендуется использовать видеокамеру 9 в режиме ручной фокусировки. Режим автофокусировки видеокамеры 9 часто приводит к срыву видеоизображения.

Подготовка измерительной ячейки 1. К электродам 4 ячейки 1 (фиг. 1) припаиваются контактные проводники с выхода усилителя 2, например, Г3-112/1. Далее ячейку 1 промывают дистиллированной водой и помещают в сушильный шкаф при температуре 60 °С, до полного испарения воды. Ячейка 1 жестко закрепляется на подвижном столе микроскопа 8 так, чтобы зазор 5 между электродами 4 находился в центре поля зрения микроскопа 8. Расстояние между электродами 4 в ячейке 1, амплитуда колебаний частицы измеряются с погрешностью не более 0,5 мкм, например, с помощью измерительной линейки сравнения (мера малой длины) производства Федерального государственного унитарного предприятия Сибирский научно-исследовательский институт метрологии.

Компьютер 10 включают в сеть и запускают программу для видеозахвата, например, MovieMaker, которая входит в Windows, AdobePremiere, Nero. В компьютере 10 аппаратно должна присутствовать последовательная высокоскоростная шина (IEEE-1394 FireWire, i-Link) для обмена цифровой информацией между компьютером 10 и другими электронными блоками системы. Основное ее применение - копирование видео с видеокамеры 9 в файлы на компьютере 10 (видеозахват), фиг. 2.

Описание способа определения массы микрочастицы латекса.

В микропробирку с объемом 250 мкл вносят дистиллированную воду в количестве 190 мкл и навеску сухих мелкодисперсных латексных частиц, изготовленных из полистирола, например, производства Dow Chemical, США и диаметром ∅=(5,7±1,5)⋅10^-6 м объемом ~2÷10 мкл, и тщательно перемешивают микропипеткой. Полученную суспензию в объеме 5 мкл микропипеткой вносят в зазор 5 между электродами 4 и накрывают покровным стеклом 3. Фокусируют микроскоп 8 на латексные частицы. В зазоре между электродами 4 измерительной ячейки 1 должно наблюдаться не более 1÷10 штук микрочастиц. Если количество превышает, то путем разведения добиваются указанного условия. Если частиц не хватает, то их вносят дополнительно. Далее на электроды 4 измерительной ячейки 1 с генератора 6 подают гармоническое напряжение с амплитудой 5 В и частотой в диапазоне 1÷18 Гц. Частицы приходят в возвратно-поступательное движение между электродами 4. Осуществляется регистрация поведения частицы с помощью видеокамеры 9 и компьютера 10, входящих в систему анализа (фиг. 2).

Напряжение и частоту на электродах 4 устанавливают таким образом, чтобы амплитуда возвратно-поступательного движения частицы составляла X_m~(0,5÷0,6) расстояния между электродами 4. Выбор частоты в диапазоне 1÷18 Гц обусловлен необходимостью предупреждения возникновения биений между частотами внешнего переменного электрического поля и колебания (возвратно-поступательного движения) микчастицы. Появление биений значительно усложняет анализ амплитуды, а также скорости возвратно-поступательного движения микчастицы за определенный период.

Измерение массы осуществляют исключительно для отдельных микрочастиц, не слипшихся между собой.

Радиус частицы r_мч, амплитуда ее колебания X_m между электродами 4 измеряется с помощью подготовленной измерительной ячейки 1 (см. раздел «подготовка измерительной ячейки 1».) По показаниям частотомера 12 определяется частота гармонического напряжения на электродах 4. Далее программой в компьютере 10 производится расчет скорости возвратно-поступательного движения частицы в соответствии с уравнением

,

а искомую массу (m_мч) частицы вычисляют в соответствии с уравнением

где:

K - постоянная Больцмана, физическая постоянная 1,38 10^-23 [Дж/K], определяющая связь между температурой и энергией;

Т - температура [K];

m_пр=(2/3)ρ_жπr_мч³ - присоединенная масса частицы [кг];

ρ_ж - плотность жидкости, в которой находится частица в форме шара [кг/м³];

r_мч - радиус частицы [м];

π=3,14.

В таблице 1 приведены результаты определения массы мелкодисперсных латексных частиц, изготовленных из полистирола, производства Dow Chemical, США и диаметром ∅=(5,7±1,5)⋅10^-6 м.

Пример 2. Способ определения массы клетки (эритроцита) животных.

Процедура определения массы эритроцита животных почти полностью совпадает с примером 1. Однако существует небольшое отличие, связанное с тем, что эритроциты помещают в изотонический раствор (ИР) 0,3 М сахарозы с содержанием NaCl 2,5 мМ. Использование указанного раствора необходимо для поддержания осмотического давления снаружи и внутри клетки эритроцита на физиологическом уровне и сохранения ее целостности и биологических свойств, т.к. клетки животных в дистиллированной воде разрушаются (лизируют).

Эритроциты вносят в одноразовые пластиковые пробирки с объемом 0,25 см³ и разводят ИР. Путем разбавления добиваются такой концентрации эритроцитов, чтобы под микроскопом между электродами измерительной ячейки наблюдалось 1÷10 клеток.

В таблице 2 приведены результаты определения массы эритроцита. Из описания примеров 1 и 2 видно, что заявляемый способ обеспечивает возможность определения массы отдельных биологических и других микрочастиц с сохранением их свойств более простыми техническими средствами по сравнению с прототипом, что подтверждает достижение заявляемого технического результата.