Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ СОСУДИСТОЙ ДИСТОНИИ У КРЫС ПО ГИПОТЕНЗИВНОМУ ТИПУ

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к экспериментальной кардиологии, неврологии, диабетологии, фармакологии, и может быть использовано как для фундаментальных исследований сосудистой дистонии, обусловленной эндотелиальной дисфункцией при введении физиологического метаболита окислительного стресса - множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности, так и для скрининга препаратов, обладающих эндотелиопротективным действием, с целью ранней профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Эндотелиальная дисфункция связана с патологическими состояниями в сосудах при атеросклерозе, гипертензии и диабете [Nagase М, Hirose S., Sawamura Т., Masaki Т., Fujita Т. Enhanced expression of endothelial oxidized low-density lipoprotein receptor (LOX-1) in hypertensive rats // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1997. - V. 237. - P. 496-498.; Chen M., Nagase M., Fujita Т., Narumiya S., Masaki Т., Sawamura T. Diabetes enhances lectin-like oxidized LDL receptor-1 (LOX-1) expression in the vascular endothelium: possible role of LOX-1 ligand and AGE // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2001. - V. 287. - P. 962-968.; Chen M., Kakutani M., Minami M., Kataoka H., Kume N., Narumiya S., et al. Increased expression of lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1 in initial atherosclerotic lesions of Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. - 2000. - V. 20. - P. 1107-1115.].

В настоящее время общепризнанно, что модифицированные окислением ЛНП (моЛНП) являются основными факторами развития атеросклероза [Steinberg D., Parthasarathy S., Carew Т.Е., Khoo J.C., Witztum J.L. Beyond cholesterol. Modifications of low-density lipoprotein that increase its atherogenicity // N Engl J Med. - 1989. - V. 320. - P. 915-24; Meisinger C, Baumert J., Khuseyinova N., Loewel H., Koenig W. Plasma oxidized low density lipoprotein, a strong predictor for acute coronary heart disease events in apparently healthy, middle-aged men from the general population // Circulation. - 2005. - V. 112. - P. 651-657.].

Sawamura Т. и соавт (1997) идентифицировали лектино-подобный рецептор-1 (LOX-1) на эндотелиальных клетках как рецептор моЛНП [Sawamura Т., Kume N., Aoyama Т., Moriwaki Н., Hoshikawa Н., Aiba Y., et al. An endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein // Nature. - 1997. - V.386. - P.73-77.]. Показано, что продукты окислительного стресса и соединения, инициирующие окислительный стресс, вызывают экспрессию LOX-1 в повышенных количествах [Kume N., Murase Т., Moriwaki Н., Aoyama Т., Sawamura Т., Masaki Т., et al Inducible expression of lectin-like oxidized LDL receptor-1 in vascular endothelial cells // Circ Res. - 1998. - V. 83. - P. 322-327.].

Активация LOX-1 индуцирует генерацию активных форм кислорода и снижает высвобождение NО из эндотелиальных клеток [Cominacini L., Pasini A.F., Garbin U., Davoli A., Tosetti M.L., Campagnola M., et al. Oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) binding to oxLDL receptor-1 in endothelial cells induces the activation of NF-kappaB through an increased production of intracellular reactive oxygen species // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - P. 12633-12638; Cominacini L., Rigoni A., Pasini A.F., Garbin U., Davoli A., Campagnola M., et al. The binding of oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) to ox-LDL receptor-1 in endothelial cells reduces the intracellular concentration of nitric oxide through an increased production of superoxide //J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - P. 13750-3755.].

Активация LOX-1 в дальнейшем индуцирует экспрессию эндотелина-1, AT₁ -рецептора к ангиотензину и молекул клеточной адгезии. Наряду с этим LOX-1 усиливает адгезию активированных тромбоцитов и нейтрофилов [Sakurai К., Sawamura Т. Stress and Vascular Responses: Endothelial Dysfunction via Lectin-Like Oxidized Low-Density Lipoprotein Receptor-1: Close Relationships with Oxidative Stress // J Pharmacol. Sci. - 2003. - V. - 91. - P. 182-186.].

Таким образом, моЛНП и его специфические рецепторы LOX-1 на эндотелиальных клетках играют ведущую роль в формировании ответных внутриклеточных реакций на окислительный стресс, которые усиливают функциональные изменения в эндотелии и являются существенными для развития нарушений сосудистого гомеостаза при патологических состояниях.

Известен способ моделирования атеросклероза у крыс, который заключается в введении препарата нативных липопротеинов низкой плотности, приготовленных из сыворотки крови человека [Меньшиков И.В., Фомина К.В., Бедулаева Л.В., Сергеев В.Г. Экспериментальная модель атеросклероза у крыс, вызванного иммунизацией нативными липопротеинами человека // Вестник Удмуртского университета. - 2012. - Вып. 1. - С. 80-86.]

Недостатками данного способа являются:

- необоснованность предположения авторов об иммунном ответе крыс именно на нативные человеческие ЛНП, хотя ранее в работе [Calara F., Dimayuga P., Niemann A., Thyberg J., Diczfalusy U., Witztum J.L., et al. An Animal Model to Study Local Oxidation of LDL and Its Biological Effects in the Arterial Wall // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1998. - V. 18. - P. 884-893.] было показано, что введение человеческих нативных ЛНП крысам вызывает окисление последних в артериальной стенке и вся патологическая цепь событий при экспериментальном атеросклерозе обусловлена окисленными in vivo человеческими ЛНП;

- в работе не проводили оценки развития эндотелиальной дисфункции на ранних сроках введения препарата по измерению гемодинамических показателей у экспериментальных животных.

Описаны способы моделирования сосудистых заболеваний на животных [Chen М, Masaki Т. and Sawamura Т. LOX-1, the receptor for oxidized low-density lipoprotein identified from endothelial cells: implications in endothelial dysfunction and atherosclerosis // Pharmacol. Ther. - 2002. - V. 95. - P. 89 - 100; Nagase M., Hirose S., Sawamura Т., Masaki T. and Fujita T. Enhanced expression of endothelial oxidized low-density lipoprotein receptor (LOX-1) in hypertensive rats // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. -V. 237. - P. 496 - 498; Chen M., Nagase M., Fujita Т., Narumiya S., Masaki Т., Sawamura T. Diabetes enhances lectin-like oxidized LDL receptor-1 (LOX-1) expression in the vascular endothelium: possible role of LOX-1 ligand and AGE // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - V. 287. - P. 962 - 968; Chen M., Kakutani M., Minami M., Kataoka H., Kume N., Narumiya S., et al. Increased expression of lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1 in initial atherosclerotic lesions of Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2000. - V. 20. - P. 1107-1115].

Недостатками данных работ являются исследования только экспрессии лектиноподобных рецепторов к моЛНП у экспериментальных животных на поздних стадиях патологического процесса, а также отсутствие оценки развития эндотелиальной дисфункции на ранних сроках по изменению гемодинамических показателей у экспериментальных животных.

Таким образом, в доступной литературе нами не обнаружены работы по моделированию сосудистой дистонии по гипотензивному типу у животных.

Задачей настоящего изобретения является разработка легковоспроизводимой, простой и быстрой модели сосудистой дистонии у крыс, индуцированной эндотелиальной дисфункцией при однократном внутрибрюшинном введении множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛНП), приготовленных из сыворотки крови больных с атеросклерозом каротидных артерий.

Технический результат достигается внутрибрюшинным однократным введением самцам крыс популяции Wistar множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности, приготовленных из сыворотки крови больных атеросклерозом каротидных артерий, в дозе 200 мкг по белку, оценкой гемодинамических показателей развития сосудистой дистонии и ее последующего течения по гипотоническому типу за счет стабильного снижения артериального давления до 80 - 85 мм рт. ст.

Способ осуществляется следующим образом.

Препарат множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности выделяли из сыворотки крови больных с атеросклерозом каротидных артерий, как описано в работе [Шойбонов Б.Б., Шойбонова Б.В. Способ определения атерогенности крови человека // Патент РФ №2497116 от 27.10.2013 г. ]. Эффективную дозу определяли в тесте связывания комплемента, как описано в работе [Шойбонов Б.Б., Баронец В.Ю., Панченко Л.Ф., Собенин И.А., Пальцын А.А., Кубатиев А.А. Среда и способ определения множественно модифицированных липопротеинов сыворотки крови человека // Патент РФ №2444014 от 27.02.2012 г.].

Эксперименты выполнены на крысах-самцах популяции Wistar с массой тела 300-350 г (n=8).

Степень развития сосудистой дистонии оценивали по гемодинамическим показателям (систолическое артериальное давление - САД, частота сердечных сокращений - ЧСС).

Предварительно (за 2-3 дня до проведения опытов) животных адаптировали к процедуре эксперимента путем помещения их в пластиковые пеналы на 3 часа с закрепленной на хвосте манжетой, содержащей датчики САД и ЧСС.

С целью моделирования сосудистой дистонии вводили препарат ммЛНП однократно внутрибрюшинно. Контрольным животным (n=8) вводили физиологический раствор в том же объеме внутрибрюшинно.

Непосредственно после введения препарата ммЛНП начинали регистрацию АД и ЧСС на хвостовой артерии у ненаркотизированных, иммобилизированных в пластиковых пеналах крыс неинвазивным способом с использованием системы NIBP («ADInstruments», Australia) с интервалом 5-10 мин в течение 3 часов.

Исходные значения САД и ЧСС у разных животных были вариабельны, в связи с этим изменения этих показателей в ответ на воздействия выражали в процентах от фонового значения. При обработке данных для приведения данных к одной временной сетке применяли метод интерполяции величин САД и ЧСС с использованием кубических сплайнов. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t критерия Стьюдента, значения считали достоверными при р<0.05.

Все эксперименты проводили в соответствии с Хельсинкской декларацией о гуманном отношении к животным.

Пример конкретного выполнения

Проведенные эксперименты показали, что однократное внутрибрюшинное введение ммЛНП в дозе 200 мкг по белку вызывает у всех крыс отчетливую сосудистую дистонию в виде резких колебаний САД уже в первые 5-10 мин после инъекции. При этом наблюдается чередование гипер- и гипотензии с перепадами значений САД от исходных на 50-60 мм рт. ст., а у отдельных животных на 80-90 мм рт. ст. К 70-100 мин регистрации у всех крыс колебания САД сглаживались и данный показатель стабилизировался на уровне 80-85 мм рт. ст. Примеры индивидуальной динамики САД в ходе эксперимента после введения ммЛНП приведены на рис. 1.

Изменения динамики ЧСС после введения ммЛНП были выражены в меньшей степени и не коррелировали с изменениями САД. Примеры индивидуальной динамики ЧСС в ходе эксперимента после введения ммЛНП приведены на рис. 2.

При оценке динамики гемодинамических показателей (САД, ЧСС) после введения ммЛНП у животных в среднем по группе (в % по сравнению с фоновыми значениями) было обнаружено, что тенденция к гипотензии появляется уже через 20-30 мин, данное изменение становится достоверным (р<0,05) к 60 мин регистрации и сохраняется до конца эксперимента (рис. 3А). При этом достоверных изменений ЧСС выявлено не было (рис. 3Б.).

Введение физиологического раствора у контрольных животных не вызывало существенных сдвигов гемодинамических показателей. Типичный пример индивидуальной динамики систолического АД (А) и ЧСС (Б) в ходе эксперимента после введения физиологического раствора представлен на рис. 4. Все изменения САД (А) и ЧСС (Б) инъекций физиологического раствора в ходе эксперимента в среднем по группе по сравнению с фоном были статистически не значимыми (рис. 5).

Таким образом, полученные данные о динамике гемодинамических показателей после однократного внутрибрюшинного введения ммЛНП свидетельствуют, что данное воздействие индуцирует острую сосудистую дистонию по гипотензивному типу и может быть использовано как способ ее моделирования.