Результат интеллектуальной деятельности: Способ определения концентрации пероксида водорода в выдыхаемом воздухе у животных

Изобретение относится к области ветеринарии и касается способа определения концентрации пероксида водорода в выдыхаемом воздухе у животных и может быть использовано при определении их заболевания. Выдыхаемый воздух у животных насыщен водяными парами, которые могут быть конденсированы при охлаждении. Помимо водяных паров, в выдыхаемом воздухе у животных содержится более 200 летучих и нелетучих веществ, в том числе и малые количества пероксида водорода. Известно, что иммунные клетки, принимающие участие в развитии воспалительного процесса (эозинофилы, макрофаги, нейтрофилы), продуцируют активные формы кислорода, в том числе и пероксид водорода (Н₂О₂). Установлено, что концентрация Н₂О₂ в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) у человека и животных при воспалительных заболеваниях органов дыхания (хронический бронхит, бронхиальная астма, пневмония и др.) существенно повышается и может использоваться для диагностики и контроля эффективности их лечения (Hydrogen peroxide in exhaled breath condensate: A clinical study / Nagaraja C. [et al.] // Lung India. - 2012. - V. 29 N.2. - P. 123-127).

Из источников информации известно, что спектрофотометрические методы измерения Н₂О₂ имеют сравнительно низкую чувствительность к пероксиду водорода, минимальная концентрация пероксида водорода в растворе для точного определения его количества должна составлять не менее 100 нмоль Н₂О₂ (A Novel Method for the Determination of Hydrogen Peroxide in Bleaching Effluents by Spectroscopy / Q. Zhang [et al.] // BioResources. - 2013. - V. 8. N 3. - P. 3699-3705; Reinhold P. Exhaled breath condensate: lessons learned from veterinary medicine / P. Reinhold, H. Knobloch // J. Breath. Res. - 2010. - V. 4. P. 1-15). Также известен способ оценки концентрации пероксида водорода с помощью электрода на основе берлинской лазури (ферроцианид трехвалентного железа), являющейся высокоэффективным электрокатализатором восстановления пероксида водорода. Недостатком данного метода является сложность анализа и низкий (по отношению к флуорометрическим методам) порог чувствительности к Н₂О₂ (Ricci F. Sensor and biosensor preparation, optimisation and applications of Prussian Blue modified electrodes / F. Ricci, G. Palleschi // Biosens. Bioelectron. - 2005. - V. 21. N. 3. - P. 389-407; Reinhold P. Exhaled breath condensate: lessons learned from veterinary medicine / P. Reinhold, H. Knobloch // J. Breath. Res. - 2010. - V. 4. P. 1-15).

В качестве прототипа выбран способ, реализуемый с помощью устройства для сбора конденсата выдыхаемого воздуха у животных (патент RU 134772 U1; МПК А61В 5/00, 2013). Устройство содержит сменный контейнер-накопитель, выполненный из полипропилена, снабженный крышкой, имеющей отверстия для прохода трубок. Трубки соединяют полость сменного контейнера-накопителя со спирометром, а также полость сменного контейнера-накопителя с передней камерой дыхательной маски. Маска дыхательная в составе устройства включает переднюю камеру, клапан вдоха и клапан выдоха. Контейнер-накопитель установлен в холодильную камеру, заполненную льдом или охлаждающей смесью. Маска дыхательная позволяет герметично фиксировать устройство на морде животного, причем клапаны вдоха и выдоха в ее составе не дают смешиваться вдыхаемому и выдыхаемому воздуху при спонтанном дыхании и направляют поток выдыхаемого воздуха через силиконовую трубку в сменный контейнер-накопитель КВВ, помещенный в холодильную камеру, закрытую снаружи теплоизоляционным кожухом. Недостатком является то, что в описании к устройству отсутствуют методики непосредственной оценки концентрации пероксида водорода в КВВ после его сбора.

Измерение концентрации пероксида водорода в КВВ в описываемом способе осуществляется флуорометрическим методом с помощью зонда Amplex Red Ultra. Технический результат - упрощение сложности анализа и повышение порога чувствительности к Н₂О₂ способа достигается тем, что определение концентрации пероксида водорода в выдыхаемом воздухе у животных осуществляется путем флуорометрического измерения концентрации Н₂О₂ с использованием красителя Amplex Red Ultra в 1 мл среды следующего состава: 20 мМ HEPES (рН 7,4); 1 мМ ЭДТА; 10 мкм Amplex Red Ultra; 4 ед. пероксидазы хрена.

Способ определения концентрации пероксида водорода в выдыхаемом воздухе у животных реализуется следующим образом. Для анализа содержания пероксида водорода в выдыхаемом воздухе у животных вначале проводят его конденсирование и охлаждение с помощью устройства для сбора конденсата выдыхаемого воздуха у животных (патент RU 134772 U1; МПК А61В 5/00, 2013), учитывают объем КВВ, образующийся из 100 литров выдыхаемого воздуха. Сразу после процедуры сбора пробы КВВ замораживают в жидком азоте и хранят при -196°С до проведения исследований. Для измерения концентрации пероксида водорода отбирают 50 мкл КВВ и добавляют во флуорометрическую кювету, содержащую 1 мл раствора, который содержит следующие реагенты: 20 мМ HEPES (рН 7,4), 1 мМ ЭДТА, 10 мкм Amplex Red Ultra и 4 ед. пероксидазы хрена. Amplex Red Ultra способен улавливать пероксид водорода в концентрации 10 нмоль. Данный флуоресцентный краситель широко применяется для оценки скорости продукции H₂O₂ электрон-транспортной цепью митохондрий. Реагент Amplex Red Ultra (Invitrogen USA) - бесцветное вещество, активно вступающее в реакцию с пероксидом водорода в соотношении 1:1 с образованием устойчивого флуоресцентного комплекса резоруфина. Далее измерение проводится на спектрофлуориметре с волной облучения 568 нм и волной эмиссии 581 нм. До начала измерения либо после измерения проводится калибровочный анализ с использованием раствора пероксида водорода известной концентрации. В кювету добавляют порции Н₂О₂ от 10 до 100 нмоль (5-7 добавок) и регистрируют соответствующие уровни флуоресценции. Далее строят калибровочную прямую (на оси абсцисс откладывают концентрацию пероксида водорода, на оси ординат - интенсивность флуоресценции) и, учитывая разбавление КВВ в кювете с раствором, находят искомые концентрации пероксида водорода в КВВ. Зная объем КВВ, образующийся из 100 л выдыхаемого воздуха, и концентрацию пероксида водорода в КВВ, рассчитывают содержание пероксида водорода в 100 л выдыхаемого воздуха. Способ поясняется примером (Таблица 1).

В зависимости от вида животного, его физиологических параметров, а также условия содержания животного пределы нормальных концентраций Н₂О₂ в КВВ могут варьировать в широких пределах. Предлагаемый способ определения концентраций Н₂О₂ в КВВ является высокочувствительным и легко воспроизводимым. Его можно использовать для диагностики и контроля эффективности лечения животных с легочными заболеваниями.

Источники информации

1. Патент RU 134772 U1; МПК А61В 5/00. Устройство для сбора конденсата выдыхаемого воздуха у животных / Черницкий А.Е., Рецкий М.И., Золотарев А.И.; заявитель и патентообладатель Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИВИПФиТ Россельхозакадемии); заявл. 30.07.2013, опубл. 27.11.2013. Бюл. №33.

2. A Novel Method for the Determination of Hydrogen Peroxide in Bleaching Effluents by Spectroscopy / Q. Zhang [et al.] // BioResources. - 2013. - V. 8 N 3. - P. 3699-3705.

3. Hydrogen peroxide in exhaled breath condensate: A clinical study / Nagaraja C. [et al.] // Lung India. - 2012. - V. 29. N.2. - P. 123-127.

4. Reinhold P. Exhaled breath condensate: lessons learned from veterinary medicine / P. Reinhold, H. Knobloch // J. Breath. Res. - 2010. - V. 4. P. 1-15.

5. Ricci F. Sensor and biosensor preparation, optimisation and applications of Prussian Blue modified electrodes / F. Ricci, G. Palleschi // Biosens. Bioelectron. - 2005. - V. 21 N. 3. - P. 389-407.